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Función de la proteína Marcks en las exocitosis que intervienen en la fertilización

Marcks function in regulated exocytosis participating in fertilization

 

Director: MICHAUT, Marcela Alejandra

Correo electrónico: mmichaut@fcm.uncu.edu.ar

 

Integrantes: MORALES, Alfonsina; CASTILLO BENNETT, Jimena; RODRIGUEZ PEÑA, Marcelo; BELLO, Oscar Daniel

 

Resumen Técnico: Tanto el ovocito como el espermatozoide sufren exocitosis reguladas a distintos tiempos durante su encuentro. El espermatozoide libera su contenido acrosomal durante la reacción acrosomal para fecundar el ovocito, y el ovocito libera el contenido de los gránulos corticales durante la reacción cortical para bloquear la poliespermia. PKC ha sido involucrada en estas exocitosis, sin embargo se desconoce cuáles son los blancos de su actividad fosforilante. El objetivo general de este proyecto es estudiar la función de proteínas “targets” de PKC en la reacción acrosomal y en la reacción cortical.  Este proyecto propone estudiar específicamente el rol de la proteína MARCKS que es el principal sustrato de PKC en diversos tipos celulares. Hemos descripto la presencia de MARCKS en ovocitos de ratón (Michaut et al., 2005) y nuestros resultados preliminares  indican que MARCKS está presente en el acrosoma de espermatozoides humanos. Nuestra hipótesis de trabajo es que MARCKS es parte del mecanismo molecular que conduce la fusión de membranas en la exocitosis. Para determinar la función de MARCKS en la exocitosis acrosomal utilizaremos un modelo de espermatozoides humanos permeabilizados con estreptolisina O. Contamos con el plásmido para expresar el dominio efector de MARCKS-GST. Hemos preparado distintas mutantes de este dominio que alteran su afinidad por membrana y analizaremos su efecto en la exocitosis acrosomal. Para estudiar la exocitosis de gránulos corticales usaremos ovocitos de ratón de hembras superovuladas hormonalmente. En este caso microinyectaremos las mismas proteínas ensayadas en espermatozoides como así también las sobrexpresaremos por microinyección del correspondiente RNAm fusionado con GFP. En todos los casos, las células serán fijadas, teñidas con lectinas y anticuerpos fluorescentes. Los resultados serán analizados y cuantificados por microscopía de fluorescencia convencional y confocal.  Además,  las células también serán analizadas por microscopía electrónica. Este proyecto utilizará dos modelos distintos de exocitosis que son complementarios entre sí. Esperamos con ellos dilucidar el mecanismo molecular de MARCKS en las exocitosis que intervienen en la fertilización. Además, este proyecto tiene el potencial de implementar líneas de investigación que involucren aspectos clínicos en reproducción humana y aspectos económicos en reproducción ganadera.

 

Summary: The oocyte as well as the sperm suffers regulated exocytosis at different times during their encounter. The sperm releases its acrosomal content during the acrosome reaction to fertilize the oocyte, and the oocyte releases the cortical granule content during the cortical reaction to block polyspermy.  PKC has been involved in both exocytoses, however it is unknown which are the targets for PKC. The general aim of this project is to study the function of PKC targets in the acrosome reaction and cortical reaction. This project specifically proposes to study the role of MARCKS, which is the main substrate of PKC in many cells. We have recently described MARCKS in mouse oocytes (Michaut et al., 2005) and preliminary results show that MARCKS localizes in human sperm acrosome. Our hypothesis is that MARCKS participates in the molecular mechanism of membrane fusion in exocytosis. To determine the role of MARCKS in the acrosomal reaction, we will use a permeabilized sperm model, using streptolysin O. We already have the MARCKS-GST plasmid and different mutants of the MARCKS effector domain. These mutants alter MARCKS affinity for membranes and we will analyze their effect on acrosome exocytosis. To study the exocytosis of cortical granules we will use mouse oocytes from superovulated female. We will microinject the same proteins assayed in sperm and also we will overexpress those proteins conjugated with GFP by microinjecting the corresponding RNAm. Cells will be fixed, stainned with specific lectins and fluorescent antybodies, and analyzed by confocal microscopy. We will also determine MARCKS localization by transmission electron microscopy. This project will use two different models of exocytosis but complementaries. We will elucidate the molecular mechanism of MARCKS in exocytosis participating in fertilization. The present project has the importance to set up new research lines that involve clinical aspect in human reproduction and economic aspect in animal reproduction.