06/J285
Proteínas de golpe de calor, estrés oxidativo y tumorogénesis mamaria
Heat shock proteins, oxidative stress and mammary tumorigenesis
Director: VARGAS ROIG, Laura María
Correo electrónico: vargasl@lab.cricyt.edu.ar
Integrantes: MONTT GUEVARA, María Magdalena; NADIN, Silvina Beatriz; PENISSI, Alicia Beatriz; JAHN, Graciela Alba; HAPON, María Belén; SOAJE, Marta; VALDEZ, Susana Ruth
Resumen Técnico: Los objetivos del presente proyecto son: 1) Estudiar si las proteínas de golpe de calor Hsp27, Hsp70 y Hsp90 regulan, a través de la modulación del glutatión y de la enzima superóxido dismutasa, el estrés oxidativo inducido por doxorrubicina en células tumorales humanas de mama. 2) Estudiar la expresión del ARNm de Hsp27, Hsp84 y Hsp86 en tumores mamarios inducidos por DMBA en ratas OFA hr/hr y en tumores que involucionan como producto de la preñez/lactancia. Nuestras hipótesis.son: a) Las Hsps confieren resistencia a la doxorrubicina, modulando el estrés oxidativo producido por dicha droga y b) Las Hsps participan en el proceso de tumorogénesis mamaria inducida por DMBA en ratas OFA hr/hr. El proyecto se realizará utilizando dos modelos experimentales: 1) la línea celular MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama humano) y 2) ratas OFA hr/hr En las células tumorales se inducirá la expresión de Hsps mediante un golpe de calor. Posteriormente, se incubarán las células de los grupos controles y de los grupos experimentales con diferentes dosis de doxorrubicina durante tiempos variables y se realizarán los siguientes estudios: Ensayos de sensibilidad oxidante: I.a. Exclusión del colorante azul tripán. I.b. Reducción del colorante MTT (dimetiltiazolildifenil tetrazol). II. Determinación de apoptosis por citometría de flujo: III. Expresión de las proteínas Hsp27, Hsp70 y Hsp90 por Western blot. IV. Determinación de EROs intracelulares por citometría de flujo. V. Determinación de glutatión por método colorimétrico. VI. Determinación de glutatión por cromatografía líquida de alta resolución con detección electroquímica. VII. Actividad de superóxido dismutasa. En ratas vírgenes se inducirá la formación de tumores administrando DMBA (15mg/rata a los 55 días) y se estudiará la activación de los genes de Hsp27, Hsp70, Hsp84 y Hsp86 mediante RT-PCR semicuantativa utilizando primers específicos para rata. La transferencia se haría a la comunidad científica y los beneficiarios serían becarios de grado y postgrado que forman parte del equipo de trabajo y otros grupos de investigación que estudien el rol de las proteínas de golpe de calor en el desarrollo tumoral y en la resistencia a la quimioterapia administrada a pacientes con cáncer de mama.
Summary: The goals of the project are: 1) To study whether heat shock proteins Hsp27, Hsp70 and Hsp90 modulate the oxidative stress induced by doxorubicin in breast human tumoral cells through glutathione and superoxide dismutase modulation. 2) To study the expression of the mRNA of Hsp25, Hsp84 and Hsp86 in mammary tumors induced by DMBA in OFA hr/hr rats before and after pregnancy/lactation Our hypotheses are: a) The Hsps confer resistance to doxorubicin modulating the oxidative stress produced by this drug and b) the Hsps participate in the process of mammary tumorigenesis induced by DMBA in OFA hr/hr rats. The project will be made using two experimental models: 1) The cell line MDA-MB-231 from human breast adenocarcinoma and 2) OFA hr/hr rats. The expression of Hsps will be induced by a heat shock in the tumor cell line Control and experimental groups will be exposed with different doses of doxorubicin at different times. We will perform: I. Tests of oxidative sensitivity I.a. Trypan blue exclusion technique to determine cell viability. I.b. MTT dye reduction (methil tiazol tetrazolium) to determine mitochondrial viability. II Apoptosis by flow cytometry. III. Western blot to measure Hsp27, Hsp70 and Hsp90 expression. IV. Determination of reactive oxygen species by flow cytometry. V. Determination of glutathione by colorimetric method. VI. Determination of glutathione by High-Performance Liquid Chromatography with electrochemical detection. VII: Determination of the activity of superoxide dismutase. We will induced by DMBA administration mammary tumors in virgin rats (15mg/rat at day 55) and we will study the expression of Hsp25, Hsp84 and Hsp86 genes by semiquantitative RT-PCR using gene-specific primers based on the rat gene sequence.