06/J276
Corrientes de sodio con patch-clamp en cardiomiocitos de rata con variaciones en las condiciones fisiológicas
Patch-clamp recording of sodium current in rat cardiomyocytes with variations in physiological conditions
Director: SALDEÑA, Teobaldo Antonio
Correo electrónico: patchuncuyo@yahoo.com.ar
Co-Director: SARAVÍ, Fernando Daniel
Integrantes: ITUARTE, Leonor María Ester; VIERA, Teresa Beatríz
Resumen Técnico: Se emplearán cardiomicitos aislados de rata Wistar-Hokkaido adulta con un peso variable entre 300 y 400 g, de ratas con dieta normal para comparar las respuestas con células en dieta hiposódica. Los miocitos se colocarán en solución extracelular normosódica, hipersódica e hiposódica luego de la aislación. Los cardiomiocitos se obtendrán de ratas anestesiadas con éter sulfúrico, se extraerá rápidamente el bloque corazón pulmones, a continuación se insertará una cánula de acrílico en la luz arterial aórtica que por su extremo se conectará a un equipo de perfusión tipo Langendorff con flujo continuo a 37°. Se perfundirá luego la preparación con soluciones para disgregar el miocardio con el objeto de obtener las células aisladas. Las células obtenidas se transferirán a una cámara de estudio con perfusión continua a temperatura controlada con las soluciones correspondientes a cada determinación, y se estudiarán mediante la técnica de patch-clamp en configuración whole-cell. Se determinarán los siguientes parámetros electrofisiológicos potencial transmembrama, capacidad de membrana específica, corriente iónica total, en condiciones de clampeo de corriente o de diferencia de potencial una vez abierto el parche de la membrana. Se emplearán distintos protocolos de pulso en células antes y después de la aplicación de tetrodotoxina. Los datos se obtendrán el programa pclamp6 disponible (o pclamp10 a adquirir) on line y se analizarán posteriormente off line con el soft clampfit desarrollados por Axon Intruments. Se registrarán en configuración whole-cell las corrientes iónicas total en células con hipoxia aguda y crónica. Para determinar la corriente de sodio se realizará la diferencia entre registros antes y después del agregado de tetrodotoxina.
Summary: Cardiomyocytes obtained from adult Wistar-Hokkaido rats (BW 300 to 400 g) from animals fed on either a normal or low sodium diet will be employed. Under ether anestesia, the heart and lungs will be removed in block and an acrylic cannula will be inserted in the aortic lumen. The cannula will be connected to a Langendorff type perfusion system with continuous flow at 37 ºC. The heart will be perfused with enzymatic solutions to obtain isolated myocardial cells. Then the cells will be placed in a chamber with continuous perfusion with thermostatized solutions of the tested composition. Myocardial cells will be studied with the match-clamp technique under whole-cell condition. The following electrophysiological variables will be measured: membrane potential, specific membrane capacity, total ionic current, under either current clamp-, or voltage clamp-condition after excision of the membrane patch. Different pulse protocols will be tested under basal condition and after addition of tetrodotoxin, to determine the magnitude of the tetrodotoxin-sensitive sodium current . Data will be obtained on line with the available program pclamp6 or with pclamp10 (to be purchased). Data will be analyzed off line with the Campfit software from Axon Instruments. Besides testing the effect of dietary sodium and extracellular sodium concentration, the effect of both chronic snd acute hypoxia on electrophysiological variables will be studied.