06/J240
Rol de ARF6 y Esfingosina 1-fosfato en la regulación de la exocitosis acrosomal
Regulation of acrosomal exocytosis by ARF 6 and Sphingosine 1-phosphate
Director: BELMONTE, Silvia Alejandra
Correo electrónico: sbelmont@fcm.uncu.edu.ar
Co-Director: MAYORGA, Luis Segundo
Integrantes: SUHAIMAN, Laila; LOPEZ, Cecilia Inés; PELLETÁN, Leonardo Enuar; ROGGERO, Carlos Marcelo
Resumen Técnico: La exocitosis es un proceso complejo y finamente regulado que involucra una serie de proteínas y lípidos que se asocian y disocian permanentemente. El objetivo de esta propuesta es identificar y caracterizar algunos de estos compuestos y elucidar la secuencia de las reacciones que ocurren así como la interacción de las diferentes vías usando la exocitosis acrosomal como modelo. Los factores de ribosilación de ADP (Arfs) son una familia de GTPasas monoméricas relacionadas a las Ras. Se ha demostrado que la fosfolipasa D (PLD) y la fosfatidilinositol 4-fosfato 5-kinasa (PI4P -5K) son efectores de Arf6 y median su función en el tráfico de membranas y en la exocitosis regulada. Nuestra hipótesis es que Arf6 juega un rol fundamental en la exocitosis acrosomal. Nuestros principales objetivos serán analizar el papel de Arf6 en la cascada de fusión que conduce a la exocitosis acrosomal y elucidar el mecanismo por el cual es activada y reclutada a las membranas. Esto se resolverá a través de ensayos funcionales en espermatozoides permeabilizados en combinación con métodos bioquímicos (Western blot, inmunofluorescencia, inmunomarcado en criosecciones para TEM). Esfingosina-1-fosfato (S1P) es un lípido bioactivo que ejerce numerosos efectos biológicos: como segundo mensajero intracelular y extracelularmente a través de sus receptores acoplados a proteína G. Cualquiera sea el caso, S1P se genera por la fosforilación de esfingosina catalizada por esfingosina quinasa. El mecanismo por el cual SK se ubica en la membrana para actuar sobre la esfingosina y cómo se regula su actividad aún no se ha dilucidado. En nuestro laboratorio se ha caracterizado previamente el efecto de S1P en la fusión de membranas durante la exocitosis acrosomal. Estas evidencias preliminares indican que S1P dispara la RA por un complejo mecanismo de señalización. Nuestra hipótesis es que la síntesis de S1P y la cascada de transducción juegan un papel fundamental en la exocitosis acrosomal. Proponemos analizar la vía de señalización modulada por S1P y determinar cómo se regula la producción de esta molécula. La estrategia a seguir será la utilización de ensayos funcionales en células intactas y permeabilizadas y métodos bioquímicos. Al desarrollar este proyecto esperamos no sólo entender aspectos fundamentales de la biología espermática sino también desentrañar rutas de señalización aún no descriptas para la RA, caracterizar las moléculas involucradas y definir la función de las mismas en el proceso de fusión de membranas
Summary: Exocytosis is a complicated and finely tuned process involving a large number of components that transiently associate and dissociate. The goal of this proposal is to identify and characterize some of these components and elucidate the sequence of the reactions they take part in as well as the cross-talk between pathways, using the acrosome reaction as model system. The ADP-ribosylation factors (Arfs) are a family of monomeric GTP-binding proteins related to the small GTPases of the Ras family. Phospholipase D (PLD) and phosphatidylinositol- 4-phosphate 5-kinase (PI4P-5K) have been shown to be downstream effectors of Arf6 and to mediate its functions in both membrane trafficking and regulated exocytosis. We hypothesize that Arf6 plays a key role in acrosomal exocytosis. Our main goals will be to analyze the role played by Arf6 in the fusion cascade leading to the acrosome reaction and to elucidate the mechanism by which Arf6 is activated and recruited to membranes. To solve these issues we will perform functional assays in permeabilized sperm in combination with other biochemical approaches (Western blot, immunofluorescence, cryosections and immunoelectron microscopy). Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a highly bioactive lipid that exerts numerous biological effects both intracellularly as a second messenger and extracellularly by binding to its G-protein-coupled receptors of the endothelial differentiation gene family. The biosynthesis of S1P is catalyzed by sphingosine kinase (SK). The mechanisms by which SK is targeted to membranes and its activity regulated are not fully understood. A previous specific aim in our laboratory was the characterization of the S1P effect on membrane fusion during acrosomal exocytosis. Initial evidence from this project indicates tha 2t S1P triggers exocytosis by a complex signaling pathway. Our hypothesis is that S1P synthesis and transduction cascade play a main role in acrosomal reaction. We propose to analyze here first the signaling network modulated by S1P and second, to determine how the production of this signaling molecule is regulated in sperm. This will be approached by means of functional assay and biochemical assays in intact and permeabilized cells. We hope this project will allow significant advances in our understanding of sperm AR at the molecular level, progress that should ultimately lead to new and better techniques for enhancing fertility, identifying and treating certain forms of male infertility and preventing conception.