06/J251

 

Aplicación de la nueva metodología molecular “MLPA” para la detección de deleciones en el gen  DMD relacionadas con distrofia muscular de Duchenne

Application of the molecular methodology “MLPA” for the detection of deletions in the DMD gene, related to muscular mistrofy of Duchenne

 

Director: ECHEVERRÍA, María Inés

Correo electrónico: miecheve@fcm.uncu.edu.ar

 

Co-Director: ROQUÉ MORENO, Maria

 

Integrantes: MAMPEL, Alejandra; MARZESE, Diego; GÓMEZ, Laura

 

Resumen Técnico: La enfermedad de Duchenne es una distrofia muscular, recesiva ligada al cromosoma X que afecta a varones. Se relaciona con alteraciones en el gen DMD que tiene 79 exones y está ubicado en Xp21. Este tipo de enfermedad es padecida por varones mientras que las mujeres son portadoras sanas de la mutación. El gen DMD no presenta un sitio caliente de mayor frecuencia mutacional y, debido a su gran extensión, su secuenciación directa es costosa y laboriosa. Por ello, el desarrollo de metodologías indirectas para la detección de algunas alteraciones en el gen DMD es de gran utilidad. Se sabe que alrededor del 60% de las mutaciones son deleciones de uno o varios de sus exones. En Argentina el diagnóstico genético molecular disponible es la detección por PCR de deleciones en solamente  9 de los 79 exones y sólo en varones afectados. Este diagnóstico es limitado por no abarcar la totalidad de los exones permitiendo sólo detectar presencia o ausencia del exón. Esto limita el diagnóstico a varones y  no permite detectar el estado de portadoras de una deleción. Esto ocurre porque las metodologías basadas en PCR no son cuantitativas y en portadoras, la deleción en un alelo queda enmascarada por la presencia del mismo exón en el otro alelo. Para el estudio de portadoras de deleciones, existe el analisis de STRs para algunas regiones del gen. En el año 2002 se desarrolló una nueva metodología molecular, llamada Multiplex Ligation Probe Amlification (MLPA) que permite cuantificar la cantidad de copias de ADN genómico. Nuestro OBJETIVO es desarrollar la aplicación de esta nueva herramienta biotecnológica económica para la detección de deleciones en el gen DMD. Nuestro grupo cuenta con resultados preliminares para la puesta a punto de la metodología que permitieron confirmar deleciones en el gen DMD previamente detectadas en varones por  PCR. A partir de estos resultados se plantea como HIPOTESIS que la metodología MLPA es sensible y eficiente para detectar deleciones en nuestro medio y que existe una correlación entre las deleciones en el gen DMD y el fenotipo del paciente afectado. Para con-firmar esto, se propone incluir un mínimo de 30 y un máximo de 50 familias en el proyecto. La METODOLOGÍA  a aplicar  co-mienza con una hibridación  de diferentes pares de sondas adyacentes complementarias a cada exón del gen. Una vez hibridadas, las sondas son posteriormente ligadas y amplificadas por PCR con un solo par de cebadores marcados. Los fragmentos produci-dos –todos de distintos tamaños, con una diferencia aproximada de 6pb- son luego analizados por electroforesis capilar en un secuenciador automático.  El RESULTADO esperado es que la metodología MLPA sea eficiente para la detección de deleciones en el gen DMD y permita aportar a complementar y ampliar el diagnóstico de Distrofia Muscular de Duchenne en Argentina. A su vez se espera que exista una correlación entre las deleciones halladas y el fenotipo de la enfermedad.  Con el desarrollo del proyecto se espera además aportar al uso de los Secuenciadores Automáticos adquiridos por la Universidad Nacional de Cuyo, permitiendo este nuevo equipamiento, brindar servicios de alta tecnología a la comunidad.

 

Summary: The Duchenne syndrome is a muscular disease that affects only males. The related gene is called DMD, it contains 79 exons and it is located on chromosome Xp21. The heredity pattern is linked to sex, so males are affected and females are carriers of the genetic alterations. The gene doesn’t present a hot spot site with higher mutation rates, and the direct se-quencing of the complete coding region is time consuming and expensive due to it’s great extension. This is the reason why the development of indirect methodologies to detect some of the mutations in the DMD gene is of great interest.  It is known that around 60% of the pathologic registered alterations are deletions in one or more exons of the DMD gene. In Argentina, the available molecular diagnosis for Duchenne consists on the detection by PCR of deletions in only 9 of the 79 exons and only in males. The limitation of this diagnosis is that it does not cover the complete coding region. But the major disadvantaje is that it is based on the detection of the presence or absence of a PCR product and therefore, it is re-stricted to the detection of deletions in males and not in femal carriers. This enormous limitation is because of the non-cuantitative character of a PCR based strategy, so, in a diploid sample, the absence of an exon on the mutated allele will be masked by the presence of the same exon on the normal allele. In 2002, a new molecular methodology has been developed for the cuantification of the number of copies of genomic DNA. It is called Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA). The main of our proyect is to develop the application of this new biotechnological tool, for the detection of deletions in the DMD gene. Our group counts whit preliminary results for the setting up of the methodology that allowed the detection of deletions, that had been previously detected by PCR on male samples. Based on these preliminar results, we postulate the hypothesis that MLPA is sensitive y efficient for the detection of deletions in Argentina and that there exists a correlation between different deletions and the clinical phenotype of the affected individuals. In order to confirm this, we propose to include a minimum of 30 and a maximum of 50 DMD families in this study. The methodology to be applied consists on an overnight hybridization of different adyacent probes on each exon of the DMD gene, the posterior ligation of the probes and amplification by PCR using one set of labeled primers. The obtained products of differents sizes are subsequently resolved by capilar electrophoresis and analyzed with the software GeneMarker. We expect that MLPA will be efficient for the detection of deletions in DMD and that these results will contribute to the diagnosis of Duchenne in Argentina. We also expect to find a significant association between the detected deletions and the clinical data of the patients. With the development of this proyect we expect to  contribute to the use of the automathic Sequencers, recently acquired by the Nacional University of Cuyo.