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Rol de las proteínas ERM, Cortactina y mDias, reguladores del citoesqueleto de actina, en la interacción de la célula hospedadora con Coxiella burnetii

Role of ERM, cortactin and mDias proteins, actin cytoskeleton regulators, in the interaction of cells with Coxiella burnetii

 

Director: BERÓN, Walter

Correo electrónico: wberon@fcm.uncu.edu.ar

 

Integrantes: AGUILERA, Milton Osmar; CARMINATI, Sergio Andrés; ROSALES Eliana María; SALINAS, Romina; BENITO, Jimena; SARTOR, Tirso

 

Resumen Técnico: La fagocitosis es el proceso por el cual fagocitos profesionales y no profesionales ingieren microbios, restos celulares, células apoptóticas y otras partículas grandes. La internalización de partículas involucra la activación de varios mecanismos de señalización que dirigen la remodelación del citoesqueleto de actina, extensión de la membrana plasmática, englobamiento y formación de fagosomas. La dinámica del citoesqueleto de actina es regulada por varias proteínas tales como las pequeñas GTPasas Rho y Arf6, N-Wasp, el Complejo Arp2/3, proteínas ERM (ezrina, radixina, moesina), cortactina y forminas. ERM, proteínas que interaccionan con actina, funcionan como “linkers” entre la membrana plasmática y el citoesqueleto de actina y participan en la formación de pseudópodos durante la fagocitosis y  en la formación de “ruffles” durante la pinocitosis y la movilidad celular. En estos procesos, las proteínas de la familia Rho y Wasp  colaboran con ERM. Cdc42 y Rac, otros dos miembros de la familia Rho, están involucradas no sólo en el control del citoesqueleto de actina, sino también en la activación de ERM. Durante la invasión de Shiguella y Streptococcus, el citoesqueleto de actina del hospedador es remodelado con la participación de las proteínas ERM. Interesantemente, ERM se han encontrado asociadas a fagosomas estimulando la nucleación de actina y fusión de membrana. Cortactina, otra proteína que interacciona con actina, participa en la movilidad celular ya que regula la formación de “ruffles” y “lamelipodios”, y la adhesión celular dependiente de integrinas. La colocalización de cortactina con actina y el complejo Arp2/3 en endosomas sugiere que cortactina está involucrada en endocitosis. Es sabido que el proceso de nucleación de actina es gobernado por cortactina, el complejo Arp2/3 y N-Wasp. Este proceso fue observado en sitios de la membrana plasmática del hospedador donde Escherichia coli, Shigella, Listeria y Neisseria interacciona con la célula hospedadora. Las forminas son proteínas que participan en la nucleación de actina en procesos tales como,  polaridad, adhesión y motilidad celular, citocinesis; procesos mediados por la interacción con GTPasas de la familia Rho. Las forminas DRFs (Diaphanous related formins) tales como mDia1, mDia2 y mDia3, están involucradas en importante función como endocitosis y fagocitosis. Nosotros estamos estudiando la fagocitosis del patógeno intracelular  Coxiella burnetii. En las células hospedadoras, esta bacteria forma una vacuola grande denominada vacuola parasitófora (VP) que presenta características autofagolisosomales. Sorpresivamente, C. burnetti puede vivir y reproducirse en este ambiente hostil. En nuestro laboratorio, hemos observado que las VP reclutan actina y la proteína Cdc42. Nuestro principal objetivo es estudiar el rol de proteínas que regulan la dinámica de actina tales como ERM, cortactina, mDias y sus proteínas reguladoras GTPasas Rho y Wasp en la fagocitosis de C. burnetti y en la biogénesis de la VP. En este proyecto se usarán diferentes materiales, metodologías y equipamientos tales como plásmidos, bacterias competentes, líneas celulares, transformación de bacterias, purificación de plásmidos, transfección de líneas celulares, inmunofluorescencia indirecta, incubadores para crecimiento bacteriano, sala de cultivo de células, flujos laminares, estufas de CO2, centrífugas y ultracentrífugas, y microscopios de fluorescencia, confocal y electrónico..

 

Summary: Phagocytosis is the process by which professional and non-professional phagocytes ingest microbes, cell debris, apoptotic cells and other large particles. Particle internalization involves activation of many signaling pathways that orchestrate remodeling of actin cytoskeleton, plasma membrane extension, engulfment and phagosome formation. Actin cytoskeleton dynamic is regulated by several proteins such as the small GTPases Arf6 and Rho, N-Wasp, Arp2/3 complex, ERM (ezrin, radixin, moesin), cortactin and formins. ERM are actin interacting proteins that function as a linker between plasma membrane and actin cytoskeleton and play important roles in pseudopodia formation during phagocytosis and ruffles formation during pinocytosis and cell motility. In these processes Wasp and Rho family proteins are collaborators of ERM. Cdc42 and Rac, others two members of the Rho family, are involved not only in controlling actin cytoskeleton but also in ERM activation. During Shiguella and Streptococcus invasion, the host actin cytoskeleton is remodeled with the participation of ERM proteins. Interestingly, ERM has been found associated to phagosomes stimulating actin nucleation and membrane fusion.  Cortactin, another actin interacting protein that plays an important role in cell motility since it regulates ruffle and llamelipodia formation, and integrin depend cell adhesion. The colocalization of cortactin with actin and Arp2/3 complex in endosomes suggests that cortactin is involved in endocytosis. It is known that the actin nucleating process is governed by cortactin, Arp2/3 and N-Wasp. This process was observed in the host plasma membrane sites where Escherichia coli, Shigella, Listeria and Neisseria interact with the host cells. Formins are proteins involved in actin nucleation in several processes such as cytokinesis, cellular adhesion and motility, which are regulated by GTPases of Rho family. DRFs (Diaphanous related formins), such as mDia1, mDia2 y mDia3, belong formin family that play role in endocytosis and phagocytosis. We are studying the phagocytosis of intracellular pathogen Coxiella burnetii. In the host cells, these bacteria form a big vacuole, called parasitophorous vacuoles (PV) that presents autophagolysosomal characteristics. Surprisingly C. burnetii can live and reproduce in this hard environment. In our laboratory we observed that the PV recruits actin and Cdc42 proteins. Our main aim is to study the role of ERM, cortactin and formins and their regulators Rho GTPasas and Wasp proteins, in the phagocytosis of C. burnetii and the biogenesis of PV. In this project we will use different materials, methodologies and equipments such as plasmids, competent bacteria, cell lines, bacterial transformation, plasmid purification, cell line transfection, indirect immunofluorescence, shakers to grow bacteria, tissue culture rooms, laminar flow hoods, CO2 incubators, centrifuges and ultracentrifuges, and fluorescence, confocal and electron microscopes.