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Aplicación del plásmido pREAL para la detección de codones de terminación prematuros en el gen BRCA1 relacionado con cáncer de mama hereditario
Application of pREAL for the detection of premature termination codons in the BRCA1 gene related to familial breast cancer
Director: MAYORGA, Luis Segundo
Correo electrónico: lmayorga@fcm.uncu.edu.ar
Co-Director: ROQUÉ MORENO, Maria
Integrantes: MARZESE, Diego; NEUILY, Rodrigo
Resumen Técnico: La generación espontánea de codones de terminación prematuros (CTPs) en genes tumor supresores es responsable del desarrollo de una gran parte de cánceres hereditarios, como el cáncer de mama hereditario. En nuestro país, la detec-ción de estas mutaciones es muy costosa y poco accesible. Resulta de gran importancia por lo tanto, el desarrollo de herramientas biotecnológicas que permitan un primer abordaje del gen durante el análisis mutacional, que sea más simple y menos costoso que la secuenciación directa del gen completo. Nuestro OBJETIVO es desarrollar la aplicación de una herramienta alternativa, económica y sencilla de utilizar, para la detección de CTPs en nuestro país. El plásmido recombinante pREAL fue desarrollado por nuestro grupo para la detección de CTPs. Su correcto funcionamiento fue verificado para dos exones de genes distintos relacionados con cáncer hereditario y su construcción fue publicada en la revista BMC Biotechnology 2006, 6:38. A partir de estos resultados se plantea una nueva HIPOTESIS: es factible des-arrollar su aplicación como primera estrategia de análisis mutacional, dejando a la secuenciación directa del gen com-pleto como segunda instancia para pacientes que no presenten CTPs. Para confirmar esto, se propone aplicar pREAL para el diagnóstico de cancer de mama hereditario que abarca el 10% de todos los cánceres de mama. Dos genes han sido relacionados con el cáncer de mama hereditario: BRCA1 (75% de los casos afectados) y BRCA2 (25% de los casos afectados). El gen BRCA1 presenta CTPs con una frecuencia superior al 60% y es un buen candidato para abordar con la estrategia del pREAL como primer paso de análisis mutacional. La METODOLOGÍA a aplicar consistirá brevemen-te en amplificar por PCR cada uno de los exones del gen BRCA1, insertarlos en pREAL, transformar bacterias deficien-tes en el gen reportero y plaquearlas en medio específico que permita analizar por la colorimetría de las colonias la pre-sencia o no de un CTP en el exón insertado. El RESULTADO esperado es que un paciente heterocigoto para un CTP en un exón del BRCA1, presente una placa de cultivo con 50% de colonias rojas correspondientes al alelo sano (sin CTP) y 50% de colonias blancas correspondientes al alelo mutado (con CTP). Como BENEFICIO, se espera que la detección de CTPs en integrantes de familias con cáncer de mama hereditario permita desarrollar nuevas estrategias y algoritmos diagnósticos para ginecólogos y oncólogos, favoreciendo la medicina preventiva y/o el diagnóstico precoz de la enferme-dad.
Summary: The spontaneous generation of premature termination codons (PTCs) in tumor suppressor genes is responsable for the development of many hereditary cancers, like familial breast cancer.The detection of these mutations is expensive in Argentina, and it requires in many cases to send the samples abroad. Therefore, the development of an alternative, simple and economic biotechnological tool to detect PTCs avoiding direct sequencing strategies will be of great importance for improving mutational analyses and presintomatic diagnosis in developing countries. In a previous proyect, supported by the SECTyP of the National University of Cuyo (2005-2007), we have developed the pREAL plasmid for the detection of PTCs. The correct function of this tool was verified in two different exons of two genes related to hereditary cancers and it’s construction has been published in BMC Biotechnology 2006, 6:38. Here, we propose to setup the conditions for the detection of PTCs in all the exons of an complete gene, as a first-approach screening strategy. Since breast cancer has a significant high frequency among the population and a 10% is estimated to occure due to hereditary causes, our propose is to apply pREAL for the detection of possible PTCs in related sequences. Two genes has been associated with to familial breast cancer: BRCA1 (75% of the patientes) and BRCA2 (25% of the patients). The BRCA1 gene presents PTCs in more than 60% of the cases, and should be a good candidate to analyse with pREAL. The methodology will briefly consist on the amplification by PCR of each exon of the BRCA1 gene, subsequently the insertion of the PCR products in pREAL, the transformation of bacteria lacking the reporter gene for finally plating them on a specific media that allows the identification of the presence of a PTC by colorimetric assays. We expect to detect a heterozygous patient carrying a PTC in one of it’s exons, by a plate which presents 50% colored colonies (healthy allele) and 50% white colonies (PTC allele). These results will yield benefits for the affected families, and permit the development of preventive strategies for oncologist and gynecologist . The detection of PTC mutations in relatives of families with hereditary cancers, allows a closer sur-veillance, a rapid intervention and a better survival for the mutated individuals.