06/J214

 

Desarrollo biotecnológico para el diagnóstico de mutaciones en oncogenes y genes tumor supresores

Development of a biotechnological tool for the diagnosis of mutations in oncogenes and tumor suppressor genes.

 

Director: MAYORGA, Luis S.

E-mail: lmayorga@fcm.uncu.edu.ar

 

Co-Director: ROQUÉ MORENO, María

 

Integrantes: REAL, Sebastián; GOMEZ, Laura

 

Resumen Técnico

La generación espontánea de codones de terminación prematuros (PTCs) en oncogenes y genes tumor supresores es responsable del desarrollo de muchos cánceres hereditarios, tales como cáncer de mama, poliposis adenomatosa familiar (FAP) y cáncer colorrectal hereditario no poliposo (HNPCC). En nuestro país, la detección de estas mutaciones es muy costosa y poco accesible. Nuestro objetivo es desarrollar una herramienta alternativa, económica y sencilla de utilizar, para la detección de PTCs en nuestro país. El diseño a desarrollar se basa en la construcción de un plásmido recombinante modificado a partir del sistema bacteriano "doble híbrido" utilizado originalmente para el análisis de interacción entre dos proteínas. Este sistema se basa en la complementación funcional de dos fragmentos de una enzima, la cuál produce un segundo mensajero necesario para la transcripción de un gen reportero. Estos fragmentos enzimáticos, al ser expresados por separado son no-funcionales. Sin embargo, si sus cDNAs son fusionados en un sólo vector, la traducción de esta unión resulta en una enzima activa y por lo tanto en la transcripción de genes reporteros. Nuestra hipótesis es que insertando una secuencia de ADN del gen humano a analizar entre ambos fragmentos enzimáticos, la presencia de un PTC en el mismo producirá un solo fragmento no funcional; y en caso de ocurrir un evento de re-iniciación de la traducción río abajo del PTC, se obtendrán dos fragmentos, pero separados y por lo tanto tampoco funcionales. Al transformar con este plásmido recombinante bacterias deficientes para ambos fragmentos enzimáticos, se podrá medir la presencia de un PTC en la secuencia del gen humano por la expresión del gen reportero. La metodología desarrollada se pondrá a punto para el gen tumor supresor humano apc, relacionado con FAP, para ser utilizado en centros públicos y privados como herramienta de diagnóstico precoz de poliposis adenomatosa familiar. Para tal fin, se requerirá el consentimiento informado de los pacientes que a su vez contarán con un asesoramiento en consultoría genética. Esta misma herramienta podrá ser puesta a punto para detectar PTCs en cualquier gen, como los BRCA1 y 2 relacionados con cáncer de mama familiar o los genes MMR relacionados con HNPCC.

La detección de mutaciones PTCs en integrantes de familias con cáncer hereditario como FAP, HNPCC o cáncer de mama familiar, permitirá un diagnóstico precoz, un seguimiento frecuente, una intervención ante el primer síntoma clínico, y por lo tanto una sobrevida mayor.

 

Summary

The spontaneous generation of premature termination codons (PTCs) in oncogenes and tumor suppressor genes is responsible for the development of many hereditary cancers, like familial breast cancer, familial adenomatous polyposis (FAP) and hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC). The detection of these mutations is expensive in Argentina, and in most of the cases it requires to send the samples abroad. The main of our project is to develop an alternative, simple, and economic tool, to detect PTCs in Argentina. Our design is based on the construction of a recombinant plasmid, starting from the original bacterial “two hybrid” system. This system is originally used to analyze in vivo the interaction of two proteins. It consists on the functional complementation of two fragments of an enzyme, which produces the necessary second messenger for the transcription of a reporter gene. When these enzymatic fragments are separately expressed, they are non functional. However, if their cDNA is fused in one vector, the translation of this union results in a functional enzyme, and thus in the transcription of the reporter gene. Our hypothesis is that if we insert a human DNA sequence between both enzymatic fragments, the presence of a PTC in this sequence will produce the translation of a single non functional enzymatic fragment; and in case of a translation reinitiating event downstream of the PTC, two separated non functional fragments will be produced. In this way, transforming bacterial strains deficient in the second messenger, we will detect the presence of a PTC in the human gene to be analyzed, by the expression of the reporter gene.

The developed methodology will be setup for the human tumor suppressor gene apc, related to FAP, and will be offert in public and private health centers as a presymptomathic diagnosis tool. In a later future, this tool can be setup to detect PTCs in different genes, like BRCA1 and 2, related to familial breast cancer, and the MMR genes related to HNPCC.

The detection of PTC mutations in relatives of families with hereditary cancers like FAP, HNPCC or Familial breast cancer, allows a closer surveillance, a rapid intervention and a better survival for the mutated individuals.