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Biotecnología de la vid: caracterización molecular de clones y obtención de plantas transformadas para estudios de interacción planta-patógeno

Biotechnology in grapevine molecular characterization of clones and transformed plants production to study plant-pathogen interaction

 

Director: MARTÍNEZ DE CRIADO, Liliana

E-mail: lmartinez@fca.uncu.edu.ar

 

Co-Director: AGÜERO, Cecilia

 

Integrantes: GUIÑAZU, Mónica; CAVAGNARO, Pablo; GUZMÁN, Javier; POSAMAI DE MENDEZ CASARIEGO, Natalina; DEI ROSSI, Marta; CASTAÑEDA, Jimena; SCARSI, Héctor; ROBLES, Paula

 

Resumen Técnico

A partir del año 1990, la viticultura argentina ha sido protagonista de un importante crecimiento del área cultivada con variedades finas de vinificación, entre ellas se mencionan a Malbec, Cabernet Sauvignon, Bonarda, Merlot, Tempranillo, Syrah, Chardonnay y Pinot Negro. Actualmente la variedad Syrah está en expansión en todo el mundo ya que produce vinos de buena calidad, opulentos, de color rojo intenso y aroma profundo. Al igual que el Malbec este cepaje en Argentina ofrece un futuro prometedor para elaborar vinos finos alta de calidad. Tanto el recambio varietal como el uso material injertado ha generado un activo comercio de plantas de vid, lo cual repercute en un marcado interés por la identificación varietal. La Estación Experimental INTA Luján de Cuyo, Mendoza, conjuntamente con la Cátedra de Viticultura de la Facultad de Ciencias Agrarias, han realizado una selección genética y sanitaria de clones de Syrah y Malbec, con el objeto de obtener un conjunto de clones que superen a los cepajes-población difundidos en el medio. Este trabajo ha llevado a la obtención de diferentes clones que presentan una importante variabilidad desde el punto de vista morfológico y de calidad de vinos elaborados. La identificación y designación correcta de los clones es de gran relevancia para la industria del vino y su legislación. La identificación de variedades de vid es muy difícil cuando se basa exclusivamente en caracteres ampelográficos y botánicos. Las técnicas actuales de biología molecular basadas en el empleo del ADN, representan una herramienta objetiva para la caracterización varietal. Entre los marcadores moleculares disponibles, los microsatélites presentan un alto nivel de polimorfismo, independencia con el ambiente, herencia Mendeliana codominante, alta repetibilidad de los resultados y han sido exitosamente desarrollados en vid. En este proyecto se propone el empleo de microsatélites para identificar y discriminar una colección de 14 clones de Syrah y 5 nuevos clones de Malbec. El ADN será extraído de acuerdo al procedimiento descripto por Bowers et al. (1993). Se emplearán 8 primers de microsatélites previamente descriptos para vid. Los productos de la reacción de PCR serán separados en geles desnaturalizantes de poliacrilamida y la visualización se realizará por tinción con nitrato de plata, como así también los productos de PCR se separán por electroforesis capilar a través del empleo de un analizador genético (secuenciador). El empleo de estos marcadores permitirá a los clones de Syrah y Malbec, los que luego serán ofrecidos a los productores con garantía, certeza y genuinidad de su procedencia.

Por otra parte, la pared de las células vegetales juega un papel fundamental en la defensa contra patógenos ya que, además de representar una barrera física, es el ambiente en el que se llevan a cabo variadas estrategias de defensa en las que intervienen numerosas proteínas. Las proteínas dirigidas a la pared celular poseen un péptido señal y son traducidas por ribosomas asociados al retículo endoplasmático. En tomate y vid, la expresión de una proteína PGIP (inhibidor de poligalacturonasa) clonada de peral, retardó la expansión de las lesiones causadas por la infección de Botrytis cinerea en hojas. La secreción de esta proteína fue confirmada por su presencia en la savia xilemática de plantas transgénicas de vid, como así también en la savia xilemática de plantas no transformadas injertadas en plantas transgénicas. Técnicas de ingeniería genética han demostrado que es posible obtener la secreción de proteínas quimera que consisten en la fusión del péptido señal de una proteína que se secreta con una proteína que no es secretada. En este proyecto se propone la identificación de proteínas presentes en la savia xilemática de la vid con el objeto de seleccionar péptidos señal que puedan ser utilizados en la secreción de otras proteínas y/o péptidos. El fin último es transformar plantas de vid que expresen quimeras de los péptidos señal seleccionados con proteínas (ej. proteínas relacionadas con defensa) y/o péptidos (ej. defensinas vegetales) cuya presencia en el apoplasto sea relevante en el estudio de la interacción planta-patógeno y en posibles estrategias terapéuticas.

 

Summary

Since 1990, the crop area with grape varieties used for production of top wine in Argentina has increased, among them: Malbec, Cabernet Sauvignon, Bonarda, Merlot, Tempranillo, Syrah, Chardonnay and Pinot Noir. Currently, the culture of Syrah has raised all over the world, since produces high quality wines, with intense red colour and deep flavour. Like Malbec, Syrah offers a great future to produce top quality wines in Argentina. The varieties changes and the use of grafted materials have generated an important business of grape plants, thus increasing the interest for varietal identification. The Estación Experimental INTA Luján de Cuyo, Mendoza, and the Chair of Viticulture, from the Facultad de Ciencias Agrarias have developed a sanitary and genetic clon selection of Syrah and Malbec varieties, with the aim to produce clones with higher performance than the original population. This work has allowed the production of differents clones which show differences from morphological and quality wines point of view. A precise and accurate clones identification is of great importance for the wine industry and legislation. The varieties identification is very difficult when is based only in the ampelographic and botanic characters. The modern molecular biology techniques based on DNA, represent an objective tool for variety characterization. Among the available molecular markers, microsatellites shows many advantages like high polymorphism, Mendelian co-domininant inheritance, environmental independence, high repetibility and have been developed for grapevine. In this project we proposed the use of microsatellite to identify and characterize 14 clones of Syrah and 5 new clones of Malbec collection. The DNA extraction will be performed according to Bowers et al (1993). Eight primers combinations described previously for grapevine will be used. The amplification products will be separated by vertical and capilar electrophoresis and will be visualized using silver staining reagents and a genetic analyser, respectively. The use of these markers will allow the characterization of Syrah and Malbec clones followed by the offering of a precise, accurate and guaranteed origin of the grapevine plants to the growers.

On the other hand, the plant cell wall play a fundamental rol in the defense against pathogens, since it represents a physical barrier and also the environment where differents defense strategies take place, among them the production of numerous proteins. The cell wall sended proteins has a signal peptide and are translated by ribosomes linked to the endoplasmic reticule. In tomato and grapevine, the PGIP protein expression cloned from pear, delayed the spread of the injury caused by Botrytis cinerea infection of the leaves. The secretion of this protein was confirmed by its presence en the xylem sap of transgenic grapevine plants, and also in the xylem sap of non-transgenic plants grafted in transgenic ones. Genetic engineer techniques have shown that is possible to obtain chimeric protein secretion by fusion of signal peptide from a secreted protein with a non-secreted protein. In this project we proposed the identification of the proteins that are in the xylem sap of the grapevine with the aim to select signal peptides that can be used in the secretion of others proteins or peptides. The final objective is to transform grapevine plants that express selected chimeric signal peptides with proteins (e.g. related to defense) and/or peptides (plants defensines) whose presence in the apoplast be relevant in the study of plant-pathogen interaction and probable therapeutic strategies.