06/J195

 

Mecanismo molecular de la exocitosis acrosomal: rol de los lípidos en la fusión de membranas

Molecular mechanisms involved in acrosomal exocytosis: role of lipids in membrane fusion

 

Director: BELMONTE, Silvia Alejandra

E-mail: sbelmont@fcm.uncu.edu.ar

 

Co-Director: MAYORGA, Luis Segundo

 

Integrantes: LÒPEZ, Cecilia Inés; DE BLAS, Gerardo Andrés; ROGGERO, Carlos Marcelo; FURLÁN, Marcelo

 

Resumen Técnico

La reacción acrosomal (RA) implica la exocitosis del acrosoma espermático regulada por calcio y es iniciada por la interacción de glicoproteínas de la zona pelúcida con receptores ubicados en la superficie del espermatozoide. La fusión de membranas involucra la interacción de una amplia variedad de proteínas, entre ellas NSF, -SNAP, pequeñas GTPasas como las Rab y proteínas específicas asociadas a membrana como las SNAREs. Durante la exocitosis las SNAREs de membrana plasmática y las de vesículas se ensamblan en complejos heterotriméricos que acercan las membranas hasta fusionar las bicapas lipídicas. En nuestro laboratorio se ha demostrado que para que ocurra la RA en espermatozoides humanos se requiere la activación NSF, -SNAP, Rab3A y el ensamble de los complejos SNARE. Mientras que la identificación y caracterización de la maquinaria proteica que participa en los procesos de fusión de membranas ha avanzado mucho en los últimos años poco se conoce sobre el rol de los lípidos. Estas moléculas constituyen los componentes estructurales de membrana más importantes por lo tanto, su papel debe ser fundamental en el proceso de fusión, aunque aún no está claro de qué modo participan. Nosotros nos preguntamos si los diferentes lípidos que constituyen las membranas aportan propiedades específicas a las mismas, diferentes de las estructurales ya conocidas, o si estos constituyen bloques inertes que son mezclados durante la fusión empujados por una maquinaria proteica activa. Este proyecto enfocará el estudio del papel de los lípidos en la exocitosis acrosomal como segundos mensajeros, como base para el reclutamiento de factores específicos o como organizadores de rafts en el proceso de fusión de membranas. Para lograr estos objetivos utilizaremos ensayos funcionales en espermatozoides permeabilizados con estreptolisina O para introducir en la gameta proteínas recombinantes, lípidos y anticuerpos, técnicas de western blot e inmunocitoquímica para microscopía confocal y de epifluorescencia. Utilizaremos además HPLC para identificar y cuantificar las diferentes moléculas lipídicas que se produzcan durante la exocitosis acrosomal inducida por diferentes estímulos. Pretendemos además, correlacionar los cambios químicos y biofísicos que ocurren en la exocitosis acrosomal con los cambios morfológicos durante las diferentes etapas del proceso de fusión. La RA no se limita a la apertura de poros de fusión, sino que también produce una extensa vesiculización cuyo mecanismo aún no se comprende completamente. Utilizando espermatozoides permeabilizados podemos bloquear la cascada de fusión en diferentes etapas, discernibles morfológicamente por TEM. Esta herramienta nos permitirá correlacionar los cambios morfológicos con la distribución de proteínas y lípidos durante el proceso. Para cumplir este objetivo realizaremos un estudio sistemático por microscopía óptica y electrónica de espermatozoides a diferentes tiempos luego del agregado de un estímulo inductor como calcio, Rab3A o AMPc o bloqueando con inhibidores diferentes etapas del proceso. Las proteínas se localizarán por inmunomicroscopía electrónica y los lípidos biotinilados se ubicarán con estreptavidina acoplada a partículas de oro coloidal de diferente tamaño lo que permitirá doble o triple marcación. Al desarrollar este proyecto esperamos no sólo entender aspectos fundamentales de la biología espermática sino también desentrañar rutas de señalización aún no descriptas para la RA, caracterizar las moléculas lipídicas involucradas y definir la función de las mismas en el proceso de fusión de membranas.

 

Summary

Interaction of sperm plasma membrane with the oocyte zona pellucida signals sperm to undergo the acrosome reaction (AR), which is a special type of regulated exocytosis. The sperm head contains a large secretory vesicle, the acrosome, overlying the sperm’s nucleus. The acrosomal membrane underlying the plasma membrane is referred to as the “outer” acrosomal membrane, and that overlying the nucleus is referred to as the “inner” acrosomal membrane. During AR, multiple fusions between the outer acrosomal membrane and the plasma membrane occur resulting in the release of the acrosomal content and exposure of molecules present on the inner acrosomal membrane. Membrane fusion involves the interaction of specific membrane-associated proteins, called SNAREs (for soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor). During exocytosis, assembly of plasma membrane and vesicle SNAREs in heterotrimeric complexes is thought to pull the fusing membranes closely together, driving bilayer fusion. Another family of proteins involved in membrane fusion are the Rabs, small GTPases that upon activation by exchanging GDP for GTP, cause the formation of large aggregates of effector proteins that contribute bringing together the membranes participating in fusion. In most membrane fusion events, both Rab-mediated tethering and SNARE-dependent docking are necessary steps for fusion to proceed. Our laboratory has demonstrated that Rab3A activation and SNARE complex assembly are required for human sperm acrosome reaction. While identification and characterization of the protein fusion machinery is forthcoming, much less attention has been given to the role(s) played by lipids in exocytosis. As the major structural component of membranes, lipids are obviously important in membrane fusion processes, but it remains unclear the extent to which lipids participate. In this project we wondered if lipids contribute properties, other than structural, to the membranes that influence their dynamics, or if they are inert building blocks that are pulled along by an active protein machinery. This project will focuse on the role(s) played by lipids as second messengers in exocytosis, as platforms to recruit specific factors involved in the fusion process and as promoters of organization of lipid domains with special biophysical properties called rafts. We will address the above mentioned aspects using a set of different techniques that have proved to be useful tools for this purpose. Aided by a streptolysin-O permeabilization model developed in our laboratory we will introduce in the gametes recombinant proteins, different lipids, and antibodies to evaluate the effect of these compounds on the AR The presence of endogenous proteins involved in the AR will be assessed by Western blot and immunocytochemistry using specific antibodies and a confocal microscope. To characterize and quantify different lipid molecules produced during AR we will use HPLC. On the other hand, specific lipid-binding domains of proteins are useful tools to follow the dynamics of lipids in living cells. We plan to use several recombinant domains to asses their effect on the secretory process and, by labelling with suitable fluorochromes, to follow by time-lapse microscopy the changes in lipid concentration and distribution during the process. To analyze lipids localization during the AR we will incorporate fluorescent lipids to the membranes of living cells.

Acrosomal exocytosis involves remarkable morphological alterations of the sperm head membrane structures. We predict that the different events that will be studied functionally will have a morphological correlate, either in the acrosome structure or in the special distribution of the proteins and lipids involved in membrane fusion. We will follow the morphological aspects of the exocytic process by analyzing the spermatozoa by TEM after interrupting the fusion cascade with different inhibitors. The distribution of endogenous or recombinant proteins will be studied by immunolocalization. Biotinilated lipids will be used to assess their distribution by TEM using streptavidin conjugated to gold particles.

We hope this project will allow significant advances in our understanding of sperm AR at the molecular level, progress that should ultimately lead to new and better techniques for enhancing fertility, identifying and treating certain forms of male infertility and preventing conception.