06/J235
Epidemiologia molecular de cepas de STEC (Shiga toxin Escherichia coli), EAEC ( Enteroaggregative Escherichia coli) y EPEC (Enteropathogenic Escherichia coli) de diferentes orígenes
Molecular epidemiology of STEC (Shiga toxin Escherichia coli), EAEC (Enteroaggregative Escherichia coli) and EPEC (Enteropathogenic Escherichia coli) strains of different sources
Director: RÜTTLER, María Elena
E-mail: mruttler@fcm.uncu.edu.ar
Co-Director: ORTIZ, Alba Marta
Integrantes: PIZARRO, Marcela Amalia; OROZCO, Juan Héctor Adolfo; CALDERÓN, Adriana Edith
Resumen Técnico
Escherichia coli diarreigénicas (DEC) constituyen una causa importante de diarrea de origen infeccioso y diarrea asociada con síndrome urémico hemolítico (SUH). En los últimos años se ha registrado un incremento en la variedad de fuentes de contaminación alimentarias y de otros orígenes. La exposición directa o indirecta a heces bovinas o humanas se ha observado en la mayoría de los casos en los que se ha identificado el origen de la infección. Se ha demostrado, además, que el ganado bovino es el principal reservorio de estos agentes infecciosos. Diversos estudios realizados indican frecuencias de aislamiento de entre un 2,6% y un 53%. Debido a que en nuestro medio se carecía de información sobre la frecuencia de presentación de estos agentes patógenos en el intestino de bovinos, así como de su transmisión a las carnes en los procesos de faenamiento, es que se elaboró el proyecto anterior, que acaba de concluir, denominado: “Investigación de STEC en ganado bovino” detectándose portación en el intestino de los animales y también transmisión a la carne durante el faenamiento. Además de STEC, hemos estudiado previamente otras dos categorías de E.coli diarreigénicas: EPEC (Escherichia coli enteropatógena) y EAEC (Escherichia coli enteroagregativa) en cepas provenientes de diarreas infantiles. Ambas categorías están, al igual que STEC, asociadas a diarreas contraídas a través del consumo de agua y alimentos contaminados. Para el presente proyecto se proponen los siguientes objetivos:
Investigar factores de patogenicidad de EPEC y EAEC en cepas obtenidas del intestino de ganado bovino destinado a consumo humano.
Realizar la subtipificación molecular de las cepas de STEC, EAEC y EPEC obtenidas.
Establecer relaciones clonales entre las cepas obtenidas del intestino de los animales y las obtenidas en trabajos anteriores en seres humanos.
Para realizar esta investigación se propone un trabajo en dos etapas: en la primera se investigarán factores de virulencia de EAEC y EPEC por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) en los caldos de cultivos conservados a -70°C obtenidos de hisopados rectales de 90 animales (ganado bovino) del proyecto anterior. En la segunda etapa se realizará una subtipificación molecular de todas las cepas obtenidas, las STEC del trabajo anterior, y las EPEC y EAEC del nuevo trabajo. Esta etapa está destinada a obtener información sobre el origen de las cepas circulantes, ya que se compararán los perfiles obtenidos con los de las cepas de origen humano.
Metodología:
Reacción de PCR para: Stx1, Stx2 (toxina Shiga) y eae (proteína intimina), para STEC y EHEC. Para EPEC, bfp (fimbria de adherencia específica) y eae (proteína intimina) y para EAEC, AAF/I (fimbria de adherencia), EAST1 (toxina termoestable) y aggR (Factor activador de la transcripción de fimbrias). Estos métodos permiten un primer nivel de identificación, muy útil para el diagnóstico rápido, como en el caso de sospecha de Síndrome Urémico Hemolítico, pero carecen de poder para discriminar el origen de las cepas, dato que es de suma importancia para vincular cepas obtenidas de casos de diarrea con aquéllas provenientes de alimentos, agua o de otros portadores. Para poder discernir por debajo del nivel de especie, se utilizarán métodos denominados de subtipificación:
RAPD (Random amplified polymorphic DNA): Esta técnica está basada en la utilización de primers aleatorios cortos, de 9 a 10 bases de longitud, los cuales hibridizan con afinidad suficiente con secuencias de DNA cromosomal a bajas temperaturas de hibridización. Este método da como resultado la obtención de bandas correspondientes a segmentos de DNA amplificados en los cuales los extremos fueron complementarios con los primers utilizados. El número y la localización de esos segmentos varía para diferentes cepas de una especie bacteriana.
PFGE (Electroforesis de campo pulsado): Esta técnica se considera habitualmente el “gold standard” de los métodos de tipificación molecular. Debido a que requiere un equipamiento especial inaccesible por el momento para nuestro laboratorio, se realizará en el Instituto Malbrán de Buenos Aires.
La inclusión de la investigación de EPEC y EAEC en este nuevo proyecto permitirá profundizar nuestro conocimiento sobre los reservorios de estos agentes patógenos y establecer hipótesis sobre los modos de transmisión a los seres humanos.
El interés de incluir métodos de tipificación molecular en el proyecto está orientado fundamentalmente a obtener perfiles de las cepas circulantes en nuestro medio, para poder compararlas con cepas de otros orígenes: humanas, como las provenientes de diarreas acuosas o relacionadas con Síndrome Urémico Hemolítico y también de las provenientes de alimentos. Además, el hecho de contar con metodología para la subtipificación de especies bacterianas permitirá colaborar en la vigilancia de brotes de diarrea causados por estos patógenos.
Summary
Escherichia coli diarrheagenic (DEC) is an important cause of infectious diarrhea in children. An increasing variety of food sources and other vehicles for its transmission have been documented. In a previous work, the prevalence of STEC (shiga toxin E.coli ) in intestinal contents and carcasses of cattle in a slaughterhouse in Mendoza was studied. The strains are conserved at -70°C. The groups of DEC included in this project are EPEC (enteropathogenic E.coli) and EAEC (enteroaggregative E.coli ). The objectives are to investigate the presence of EPEC and EAEC in the stool strains collected in the previous project and to subtyping the isolates of EPEC, EAEC and STEC by molecular methods.
The strains will be characterized by PCR using specific virulence markers for each group. The isolates will be subsequently investigated for their O:H serogroups and will be genotyped by RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) and PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis).
The results will be compared with isolates from different sources in order to determine the clonal relationship among animal and human strains.
This project will contribute to improve the knowledge of the epidemiology of this diarrheigenic agents and the identification of risk factors in order to implement preventive strategies.