César Milstein fue el segundo hijo de una pareja descendientes de inmigrantes judeo-ucraniana que llegó al pais a principios de siglo y se instalaron al sur de la provincia de Buenos Aires. 

Una vez terminado los estudios secunarios, se mudó a Capital Federal para estudiar en la Universidad de Buenos Aires. Se graduó de Licenciado en Ciencias Químicas en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales en 1952​ y cuatro años más tarde recibió su Doctorado en Química y un premio especial por parte de la Sociedad Bioquímica Argentina. Durante su juventud, militó en el movimiento anarquista universitario.​

Fue becado por la Universidad de Cambridge donde consiguió su segundo doctorado en 1960, trabajando bajo la dirección del bioquímico molecular Frederick Sanger. Sin embargo Milstein regresó a la Argentina en 1961 para hacerse cargo de la División de Biología Molecular del Instituto Nacional de Microbiología, pero sólo estuvo un año en el cargo para regresar a Inglaterra tras el golpe militar de 1962.

En Cambridge formó parte del Laboratorio de Biología Molecular y trabajó en el estudio de las inmunoglobulinas, adelantando el entendimiento acerca del proceso por el cual la sangre produce anticuerpos. Junto a G. Kölher desarrolló una técnica para crear anticuerpos con idéntica estructura química, que denominó anticuerpos monoclonales, lo que le valió el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1984.

Murió a los 74 años de edad, el 24 de marzo de 2002 en Cambridge por una afección cardiáca.