06/J293
Caracterización de la interacción entre proteínas reguladoras del citoesqueleto de actina y la vacuola que contiene a Coxiella burnetii.
Characterization of the interaction between actin cytoskeleton regulating proteins and the Coxiella burnetii-containing vacuole.
Director: BERON, Walter
Correo Electrónico: wberon@fcm.uncu.edu.ar
Integrantes: AGUILERA, Milton Osmar; CARMINATI, Sergio Andrés; ROSALES, Eliana María; SALINAS, Romina; SARTOR, Tirso.
Resumen Técnico: La fagocitosis es el proceso por el cual fagocitos profesionales y no profesionales ingieren microorganismos, células apoptóticas, restos celulares y otras partículas grandes nocivas para el organismo. La fagocitosis comprende la internalización de partículas que involucra la activación de mecanismos de señalización intracelular que producen, entre otros fenómenos, la remodelación del citoesqueleto de actina. Esta remodelación provoca la extensión de la membrana plasmática, el englobamiento de la partícula y finalmente la formación de fagosomas. El comportamiento dinámica del citoesqueleto de actina observado en ese proceso como en otros (por ej. motilidad celular), depende de varias proteínas tales como pequeñas GTPasas de la familia Rho y Arf, en particular Arf6, N-Wasp, complejo Arp2/3, proteínas ERM (ezrina, radixina, moesina), cortactina y forminas. Cortactina participa en la movilidad celular ya que regula la formación de “ruffles” y “lamelipodios”, y la adhesión celular dependiente de integrinas. La colocalización de cortactina con actina y el complejo Arp2/3 en endosomas sugiere que cortactina está involucrada en el proceso de endocitosis. Se conoce que la nucleación de actina es gobernada por cortactina, Arp2/3 y N-Wasp. Interesantemente este proceso se observó en los sitios de la membrana plasmática del hospedador donde se asocian Escherichia coli, Shigella, Listeria y Neisseria. ERM funcionan como “linkers” entre la membrana plasmática y el citoesqueleto de actina participando en la formación de pseudópodos durante la fagocitosis y en la formación de “ruffles” durante la pinocitosis y el movimiento celular. En estos procesos, las proteínas de la familia Rho y Wasp colaboran con ERM. Cdc42 y Rac, otros dos miembros de la familia Rho, están involucradas no sólo en el control del citoesqueleto de actina, sino también en la activación de ERM. Durante la invasión de Shiguella y Streptococcus, el citoesqueleto de actina del hospedador es remodelado con la participación de las proteínas ERM. Interesantemente, ERM se han encontrado asociadas a fagosomas estimulando la nucleación de actina y fusión de membrana. Las forminas participan en la nucleación de actina en procesos tales como polaridad, adhesión y motilidad celular, citocinesis, todos procesos mediados por la interacción con GTPasas de la familia Rho. Las forminas DRFs (Diaphanous related formins) tales como mDia1, mDia2 y mDia3, están involucradas en endocitosis y fagocitosis. Nosotros estamos estudiando la fagocitosis del patógeno intracelular Coxiella burnetii. En la célula hospedadora, esta bacteria forma una vacuola grande denominada vacuola parasitófora (VP) que presenta características autofagolisosomales. Sorpresivamente, C. burnetti puede vivir y reproducirse en este ambiente hostil. En nuestro laboratorio, hemos observado que las VP recluta actina, Cdc42 y Rho A, y que dicha interacción regularía la biogénesis de dicha vacuola. Recientemente observamos que cortactina participa en la fagocitosis de C. burnetti y que dicho proceso estaría regulado por el estado de fosforilación de dicha proteína. Nuestros principales objetivos son profundizar el estudio sobre el papel de cortactina en la internalización y biogénesis de la VP, y comenzar a caracterizar la participación de otras proteínas que regulan la dinámica de actina tales como mDias y ERM, y sus relaciones con las GTPasas Rho y Wasp. Deseo mencionar que este proyecto es continuación del anterior. En este proyecto se usarán diferentes materiales, metodologías y equipamientos tales como plásmidos, bacterias competentes, líneas celulares, transformación de bacterias, purificación de plásmidos, transfección de líneas celulares, inmunofluorescencia indirecta, incubadores para crecimiento bacteriano, sala de cultivo de células, flujos laminares, estufas de CO2, centrífugas y ultracentrífugas, y microscopios de fluorescencia, confocal y electrónico. Deseo destacar que este proyecto es continuación del anterior.