06/J342

Caracterización molecular de las etapas tardías de fusión de membranas durante la reacción acrosomal. Mapeo de componentes e interrelación entre vías.
Molecular characterization of membrane flision late stages during the acrosome reaction. Mapping of the molecules involved and cross talk between signaling pathways.

Director: TOMES, Claudia Nora
Correo Electrónico: ctomes@fcm.uncu.edu.ar

Integrantes: RUETE, María Celeste; BRANHAM, María Teresita; RODRIGUEZ AYALA, Juan Facundo; BUSTOS, Matías Alberto; FURLAN, Marcelo; DOMIZIO, Norberto; MEDERO, Alejandra Verónica; GUTIERREZ, Graciela.

Resumen Técnico: En todas las células exocíticas la fusión de membranas está gobernada por una exquisita y altamente conservada maquinaria proteica responsable simultáneamente de evitar la secreción prematura y garantizar la liberación instantánea al arribar la señal de calcio. Algunos componentes de esta maquinaria son proteínas integrales de la vesícula (Rab3A, R-SNAREs, sinaptotagmina) y de la membrana plasmática (Q-SNAREs), mientras que otros son solubles (a-SNAP, PTP1B, NSF, Muncl8, complexina). En espermatozoides, la exocitosis del acrosoma (reacción acrosomal, RA) requiere calcio, AMP cíclico y todas las proteínas de fusión arriba mencionadas, además de Epac. Epac es un intercambiador de nucleótidos de guanina para la proteína G monomérica Rap cuya actividad erizimática se estimula por AMP cíclico. En espermatozoides sufriendo la RA, este segundo mensajero se sintetiza por una adenilato ciclasa soluble que se activa por calcio y bicarbonato. La RA procede a través de dos vías principales: una conducente al anclado del acrosoma a la membrana plasmática mediado por Rab3- PTP1B-ix-SNAP- NSF-Muncl8-SNAREs y otra a la liberación del calcio acrosomal mediada por Rap-fosfolipasa C y canales sensibles al 1P3. Epac se ubica en una etapa temprana común a ambas. La convergencia en uno o mas puntos es esencial para lograr la exocitosis y es el objeto de este proyecto investigar a qué nivel/es se produce la interrelación entre estas vías. Se utilizarán métodos bioquímicos, de biología celular y molecular, así como un ensayo funcional para evaluar la RA desarrollado por nuestro grupo. Entre los beneficios esperados se encuentra el avance de tres tesis doctorales, publicaciones y comunicaciones a congresos.

Summary: In all exocytotic cdl lines, membrane fusion is governed by an exquisite and highly conserved protein machinery responsible for avoiding premature secretion and guarantee instantaneous release at the same time. Sorne components of this machinery are integral proteins localized to the vesicle (Rab3A, R-SNAREs, synaptotagmin) and plasma membrane (Q-SNAREs), whereas others are soluble (a-SNAP, PTP1B, NSF, Muncl8, complexin). In sperm, exocytosis of the acrosome (acrosome reaction, AR) requires calcium, cyclic AIvIP and all the flision proteins mentioned aboye. The relevant cAlvIP target is Epac, a guanine nucleotide exchange factor for the sniall GTPase Rap. A soluble adenylyl cyclase, regulated by calciurn and bicarbonate, synthesizes the cAMP required for the AR. Epac sits at a critical point during the exocytotic cascade afler which the pathway splits into two limbs, one that assembles the fusion machinery into place, and another that elicits intracellular calcium release. The goal of this proposal is to determine at what levells do these pathways cross talk and where do they converge to achieve exocytosis. To this end, we will resort to biochemical and molecular biology techniques, as well as to a funcional AP. assay developed la our laboratory. We expect the development of this project will yield publications la international, medium to high irnpact Journals, communications to meetings and the advance or fmalization of three PhD theses.