06/J292

Exocitosis regulada y rutas de transducción en las que interactúan lípidos y proteínas.
Regulated exocytosis and signal transduction pathways involving lipids and proteins.

Director: BELMONTE, Silvia Alejandra
Correo Electrónico: sbelmont@fcm.uncu.edu.ar

Co-Director: MORALES, Alfonsina

Integrantes: SUHAIMAN, Laila; PELLETAN, Leonardo Enuar; GUERRERO GIMENEZ, Martín; GINER, Federico; ROGGERO, Carlos Marcelo; FURLAN, Marcelo; MEDERO, Alejandra Verónica.

Resumen Técnico: El mecanismo molecular de la fusión entre las membranas de gránulos secretorios y plasmática ha sido estudiado en numerosos tipos celulares. El inductor y regulador del proceso exocítico por excelencia es el calcio. En los últimos años nuestro laboratorio ha identificado un gran número de proteínas indispensables para la fusión de membranas y la secuencia en la que estas funcionan. Recientemente hemos comenzado a relacionar esta maquinaria proteica con moléculas lipídicas que afectan la fusión de membranas y a demostrar una cooperación funcional entre las mismas. En este proyecto se propone: I) Identificar los mecanismos moleculares activados por distintos esfingolípidos en la exocitosis acrosomal, especialmente focalizaremos nuestra atención en la función de esfingosina 1-fosfato; II) Establecer el mecanismo molecular por el cual se regula la producción de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato durante la exocitosis, considerando a Arf6 y su efector, fosfatidilinositol 4-fosfato 5-kinasa, como moléculas proteicas clave en la modulación de este proceso. Hasta el momento se han realizado numerosas observaciones tratando de revelar los mecanismos que modulan la exocitosis regulada, pero muy pocos han logrado una explicación molecular del proceso. Esto se debe fundamentalmente a la escasez de modelos fisiológicos integrados, lo que ha restringido la posibilidad de asignarle un correlato molecular a cada proceso que ocurre dentro de la cascada de fusión. El espermatozoide posee una sola vesícula secretora, denominada acrosoma, que exocita frente al estímulo de la zona pelúcida ovocitaria. Este proceso, denominado reacción acrosomal (RA), es calcio dependiente y habilita a los espermatozoides para penetrar la zona pelúcida y fusionar con la membrana plasmática del ovocito en el proceso conocido como fertilización. La RA es un modelo privilegiado para estudiar minuciosamente la dinámica de las especies moleculares involucradas durante la exocitosis en una forma semejante a lo que ocurre "in vivo". Para resolver los interrogantes propuestos pretendemos perturbar o promover la actividad de diferentes componentes de la cascada de señalización adicionando a las gametas lípidos, proteínas recombinantes permeables o no, anticuerpos, segundos mensajeros y utilizar sondas fluorescentes para analizar cambios bioquímicos frente a los distintos tratamientos. Estos resultados se analizarán a través de ensayos bioquímicos, funcionales y morfológicos. Por lo tanto esta propuesta consiste en identificar la función de los lípidos durante la exocitosis, definir su relación con diferentes proteínas e integrarlos a las cascadas de transducción de señales ya conocidas y así poder analizar la regulación del proceso exocítico completo. De esta manera pretendemos lograr un modelo molecular integrado de exocitosis acrosomal que podría ser extrapolado a otros sistemas secretorios.

Summary: Exocytosis is a complicated and finely tuned process involving a large number of components that transiently associate and dissociate. The goal of this proposal is to identify and characterize some of these components and elucidate the sequence of the reactions they take part in as well as the cross-talk between pathways, using the acrosome reaction as model system. Sphingosine 1-phosphate (S1P) is a bioactive sphingolipid that regulates crucial physiological processes both intracellularly as a second messenger and extracellularly by binding to its G-protein-coupled receptors of the endothelial differentiation gene family. Sphingosine-1-phosphate is a highly bioactive lipid that exerts numerous biological effects. The ADP-ribosylation factors (Arfs) are a family of monomeric GTP-binding proteins related to the small GTPases of the Ras family. Phospholipase D (PLD) and phosphatidylinositol- 4-phosphate 5-kinase (PI4P-5K) have been shown to be downstream effectors of Arf6 and to mediate its functions in both membrane trafficking and regulated exocytosis. We hypothesize that Arf6 plays a key role in acrosomal exocytosis. Our main goals will be to analyze the role played by Arf6 in the fusion cascade leading to the acrosome reaction and to elucidate the mechanism by which Arf6 is activated and recruited to membranes. To solve these issues we will perform functional assays in permeabilized sperm in combination with other biochemical approaches (Western blot, immunofluorescence, cryosections and immunoelectron microscopy). The biosynthesis of S1P is catalyzed by sphingosine kinase (SK). The mechanisms by which SK is targeted to membranes and its activity regulated are not fully understood. A previous specific aim in our laboratory was the characterization of the S1P effect on membrane fusion during acrosomal exocytosis. Initial evidence from this project indicates that S1P triggers exocytosis by a complex signaling pathway. Our hypothesis is that S1P synthesis and transduction cascade play a main role in acrosomal reaction. We propose to analyze here first the signaling network modulated by S1P and second, to determine how the production of this signaling molecule is regulated in sperm. This will be approached by means of functional assay and biochemical assays in intact and permeabilized cells. We hope this project will allow significant advances in our understanding of sperm AR at the molecular level, progress that should ultimately lead to new and better techniques for enhancing fertility, identifying and treating certain forms of male infertility and preventing conception.