06/J319

Bases Morfológicas y Bioquímicas de la Exocitosis Acrosomal.
Membrane dynamics and molecular mechanisms during the acrosomal exocytosis.

Director: MAYORGA, Luis Segundo
Correo Electrónico: lmayorga@fcm.uncu.edu.ar

Integrantes: ROGGERO, Carlos Marcelo; FURLAN, Marcelo; DE BLAS, Gerardo; MEDERO, Alejandra Verónica; ZANETTI, María Natalia; GUTIERREZ, Graciela; CASTILLO, Jimena; BELLO, Oscar Daniel.

Resumen Técnico: La fusión de las gametas masculina y femenina para generar un nuevo ser es central para la supervivencia de una especie.  La secreción del contenido del gránulo acrosómico del espermatozoide al tomar contacto con la matriz extracelular que rodea el ovocito es un proceso de exocitosis regulada clave para una fertilización exitosa.  Este proyecto propone estudiar diversos aspectos morfológicos y moleculares de este proceso en espermatozoides humanos.  Nos interesa entender los cambios profundos en la topología de las membranas de la cabeza del espermatozoide que ocurren durante la exocitosis que llevan a formar vesículas híbridas y exponer sobre la superficie de la célula nuevos dominios de membranas con proteínas que son clave para el reconocimiento con el ovocito y posterior fusión de las dos células.  En este aspecto pensamos manipulando la exocitosis de modo de poder caracterizar, mediante análisis por microscopía electrónica, las diferentes etapas del proceso buscando correlacionar cambios morfológicos con eventos moleculares.  Para avanzar sobre la caracterización bioquímica de la exocitosis acrosomal vamos a explorar la regulación por fosforilación de sinaptotagmina VI -una proteína que en nuestro laboratorio hemos identificado como clave para la secreción- para lo cual se estudiarán los cambios que la fosforilación o la introducción de mutaciones fosfomiméticas ocasionan a la  asociación de distintas dominios de sinaptotagmina VI a liposomas mediante un ensayo de FRET.  También se caracterizará la desfosforilación de sinaptotagmina -utilizando proteínas purificadas y células- por calcineurina, la fosfatasa calcio/calmodulina dependiente que pensamos está involucrada en el proceso de acuerdo a datos preliminares.  Finalmente nos interesa definir los efectores de Rab3 en la exocitosis acrosomal.  Esta proteína es capaz de inducir la reacción acrosomal cuando es activada, pero los efectores que median su acción son desconocidos. Nos vamos a enfocar en RIM, una proteína que une Rab3 activada y que tiene un papel importante en otras exocitosis reguladas. Para estos estudios utilizaremos principalmente el ensayo funcional de espermatozoide permeabilizado que hemos puesto a punto y con el cual podemos ensayar los efectos de proteínas recombinantes, toxinas y anticuerpos.  Esperamos que los resultados permitan tener una idea más acabada de los mecanismos moleculares necesarios para la reacción acrosomal que es fundamentales para la fertilización y contribuyan a solucionar problemas de fertilidad e infertilidad en seres humanos y en animales.  Además, dado las características especiales de los espermatozoides, esperamos contribuir al conocimiento de aspectos comunes del proceso de exocitosis que está en la base de la función de muchas otras células secretorias fundamentales para la salud humana y animal.

Summary: Fusion between gametes is a central event for the perpetuation of the species.  The secretion of the acrosomal granule upon binding of the sperm to the egg’s zona pellucida is a regulated exocytosis event absolutely necessary for a successful fertilization.  This project will address several molecular and morphological aspects of the acrosomal exocytosis.  We are interested in the profound alterations of the membrane topology leading to the formation of hybrid vesicles and the exposure of new membrane domains that are necessary for the recognition of the egg membrane and for cell-cell fusion. We propose to analyze by electron microscopy the topology of the plasma and outer acrosomal membranes at different steps of the acrosomal exocytosis and co-relate these observations with specific molecular events. To continue with the molecular characterization of the acrosomal exocytosis, we will explore the phosphorylation-dependent synaptotagmin VI regulation. We have previously shown that this protein has a key role in the process. For this purpose, we will assess the effect of phosphorylation or the introduction of phosphomimetic mutation in the polybasic region of the C2 domains of synaptotagmin VI on the calcium-dependent association of the protein with liposomes by a FRET assay. The role of calcineurine in the desphosphorylation of synaptotagmin VI will be analyzed using purified proteins and cells.  Finally, we are interested in the characterization of the downstream effectors of Rab3 in the acrosomal exocytosis.  We will focus in RIM, a protein that binds activated Rab3 and has an important role in other regulated exocytosis.  For this aim, we will use the human permeabilized sperm model that we have standardized.  This assay allows us to test the effect of membrane impermeable reagents such as recombinant proteins and antibodies.  We expect to integrate our results and those of other authors in a working model that will be useful for the rational design of solutions for fertility and sterility problems in humans and animals. Moreover, because of the special characteristics of sperm exocytosis, we expect to contribute to the characterization of molecular events that are common to the regulated exocytosis process in other secretory cells having central roles in human and animal physiology.