06/J319
Bases Morfológicas y Bioquímicas de la Exocitosis Acrosomal.
Membrane dynamics and molecular mechanisms during the acrosomal exocytosis.
Director: MAYORGA, Luis Segundo
Correo Electrónico: lmayorga@fcm.uncu.edu.ar
Integrantes: ROGGERO, Carlos Marcelo; FURLAN, Marcelo; DE BLAS, Gerardo; MEDERO, Alejandra Verónica; ZANETTI, María Natalia; GUTIERREZ, Graciela; CASTILLO, Jimena; BELLO, Oscar Daniel.
Resumen Técnico: La fusión de las gametas masculina y femenina para generar un nuevo ser es central para la supervivencia de una especie. La secreción del contenido del gránulo acrosómico del espermatozoide al tomar contacto con la matriz extracelular que rodea el ovocito es un proceso de exocitosis regulada clave para una fertilización exitosa. Este proyecto propone estudiar diversos aspectos morfológicos y moleculares de este proceso en espermatozoides humanos. Nos interesa entender los cambios profundos en la topología de las membranas de la cabeza del espermatozoide que ocurren durante la exocitosis que llevan a formar vesículas híbridas y exponer sobre la superficie de la célula nuevos dominios de membranas con proteínas que son clave para el reconocimiento con el ovocito y posterior fusión de las dos células. En este aspecto pensamos manipulando la exocitosis de modo de poder caracterizar, mediante análisis por microscopía electrónica, las diferentes etapas del proceso buscando correlacionar cambios morfológicos con eventos moleculares. Para avanzar sobre la caracterización bioquímica de la exocitosis acrosomal vamos a explorar la regulación por fosforilación de sinaptotagmina VI -una proteína que en nuestro laboratorio hemos identificado como clave para la secreción- para lo cual se estudiarán los cambios que la fosforilación o la introducción de mutaciones fosfomiméticas ocasionan a la asociación de distintas dominios de sinaptotagmina VI a liposomas mediante un ensayo de FRET. También se caracterizará la desfosforilación de sinaptotagmina -utilizando proteínas purificadas y células- por calcineurina, la fosfatasa calcio/calmodulina dependiente que pensamos está involucrada en el proceso de acuerdo a datos preliminares. Finalmente nos interesa definir los efectores de Rab3 en la exocitosis acrosomal. Esta proteína es capaz de inducir la reacción acrosomal cuando es activada, pero los efectores que median su acción son desconocidos. Nos vamos a enfocar en RIM, una proteína que une Rab3 activada y que tiene un papel importante en otras exocitosis reguladas. Para estos estudios utilizaremos principalmente el ensayo funcional de espermatozoide permeabilizado que hemos puesto a punto y con el cual podemos ensayar los efectos de proteínas recombinantes, toxinas y anticuerpos. Esperamos que los resultados permitan tener una idea más acabada de los mecanismos moleculares necesarios para la reacción acrosomal que es fundamentales para la fertilización y contribuyan a solucionar problemas de fertilidad e infertilidad en seres humanos y en animales. Además, dado las características especiales de los espermatozoides, esperamos contribuir al conocimiento de aspectos comunes del proceso de exocitosis que está en la base de la función de muchas otras células secretorias fundamentales para la salud humana y animal.