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Stress y cambios asociados a la metilación de ADN en plantas de ajo (allium sativum L.) cultivadas in vitro.
Stress and changes associated with DNA methylation in garlic plants (Allium sativum L.) cultivated in vitro.

Director: GARCIA LAMPASONA, Sandra Claudia
Correo Electrónico: sgarcia@fca.uncu.edu.ar

Co-Director: MASUELLI, Ricardo Williams

Integrantes: BURBA, José Luis; CONCI, Vilma

Resumen Técnico: El medio utilizado para prácticas de cultivo de tejidos o cultivo in vitro así como el  ambiente físico en el cual se desarrolla esta técnica, han demostrado ser de capital importancia en los procesos de mutagénesis. Los cambios en la secuencia de un gen y la metilación de la citosina (C) como causantes de las variaciones han sido detectados utilizando enzimas de restricción y análisis de Southern blot (Kaeppler & Phillips, 1993). Las variaciones en el número de copias de las secuencias repetitivas también han sido demostradas por diferentes autores (Landsmann & Uhrig, 1985; Brettell et al., 1986). Se propone desarrollar este trabajo, basándose en la hipótesis propuesta por Kaeppler y Phillips (1993), la cual implica que los cambios en la metilación del ADN son el factor causal de la mutagénesis in vitro produciéndose cambios de una base por otra, recombinación somática y replicación tardía de la heterocromatina como principales respuestas al estrés impuesto por el ambiente, en este caso el medio ambiente lo constituye el cultivo in vitro. Se han observado diferencias cuali y cuantitativas en plantas originadas a partir de un clon. Esta variabilidad puede deberse al efecto de los constituyentes del medio de cultivo, al tiempo de permanencia in vitro, a la técnica de cultivo in vitro per se o a la acumulación de mutaciones a través de los sucesivos subcultivos. En este trabajo se propone determinar si el cultivo in vitro genera cambios genéticos o epigenéticos (variación somaclonal) en plantas de ajo micropropagadas. Se trabajará con explantos de ajo común Allium sativum L. provenientes del cultivo in vitro de “shoot tips” de un clon. Para determinar los posibles epigenéticos se utilizarán marcadores moleculares MSAP (Methylation Sensitive Amplified Polymorphism) (Reyna-López et aL, 1997) con el fin de analizar niveles de polimorfismo que proveerán una evidencia indirecta del estado de metilación del ADN, reflejando de esta manera las bases moleculares de la variación somaclonal observada en clones de ajo. La información correspondiente a la metilación total del genoma se completará con datos obtenidos mediante el empleo de la técnica de HPCE (High Perfomance Capillary Electrophoresis) y las modificaciones que ocurran a nivel de cromosomas se pondrán de manifiesto mediante citometría de flujo. Una de las aplicaciones de este trabajo es definir el momento preciso de salida de los explantos de cultivo in vitro o determinar el número de repiques al cual serán sometidos los mismos, garantizando de esta manera la estabilidad genética de los materiales micropropagados.

Summary: The media used for in vitro tissue culture as well as the physical atmosphere in which this technique is developed, have demonstrated to be of great importance in the mutagenesis processes. The changes in the gene sequence and the cytosine methylation (C) as causing of variations have been detected using restriction enzymes and analysis of southern blot (Kaeppler & Philips, 1993). The variations in the number of copies of those repetitive sequences have also been demonstrated for different authors (Landsmann & Uhrig, 1985; Brettell et al., 1986). We intend to develop this work, based on the hypothesis proposed by Kaeppler and Philips (1993), which implies that those changes in DNA methylation are the causal factor of the in vitro mutagenesis, taking place changes of a base for other, somatic recombination and late chromatine replication as main answers to the stress imposed by the environment. In this case the environment is the in vitro culture. It has been observed qualitative and quantitative differences in plants originated from the same done. This variability can be due to the effect media constituents, at the time of permanency in vitro and to the in vitro technique per se or to the accumulation of mutations through the successive subcultures. We will intend to determine if the in vitro culture generates genetic or epigenetic changes (somaclonal variation) in micropropagated plants of garlic. We will work with explants of cominon garlic (Allium sativum L) coming from in vitro cultures of shoot tips. In order to determine the possible epigenetics changes we will use MSAP (Methylation Sensitive Amplified Polymorphism) (Reyna-López et al., 1997) with the purpose of analyzing different levels of polymorphism that will provide an indirect evidence of the state of DNA methylation, reflecting in this way the molecular bases of the somaclonal variation observed in garlic clones. The information corresponding to the total genome methylation will be completed with data obtained from the use of the technique of HPCE (High Perfomance Capillary Electrophoresis). The modifications that take place at level of chromosomes will be shown by means of flow cytometry. One of the applications of this work is to define the precise exit moment for the explants cultivated in vitro or tin others words, to determine the number of subcultures assuring in this way the genetic stability of the micropropagated material.