06/J323

Rol de dominios submembranales en las respuestas al daño en el sistema nervioso.
The role of submembrane domains in responses to nervous system damage.

Director: PATTERSON, Sean Ingram
Correo Electrónico: seanpat@fcm.uncu.edu.ar

Integrantes: GONZALEZ POLO, Virginia; LAURITO, Sergio Roberto; SAVASTANO, Luis Emilio.

Resumen Técnico: Los dominios submembranales representan plataformas de transducción de señales asociadas con la membrana plasmática con un papel importante en el control normal de funciones fisiológicas y en procesos patalógicos. El objetivo de este proyecto es contribuir a nuestro conocimiento de cómo la compartimentalización subcelular de proteínas de señalización, específicamente su presencia en dominios membranales conocidos como “rafts”, contribuye a los procesos de degeneración y regeneración del sistema nervioso. En trabajos previos (incluyendo el proyecto anterior de CIUNC) hemos mostrado cambios en la expresión de varias proteínas aciladas durante: i) sinaptogénesis, ii) después de tratamiento crónico con alcohol seguido de períodos de abstinencia, iii) tratamiento con factores de crecimiento y iv) después de axotomia. Suponemos que estos cambios están relacionados con los papeles específicos de dichas proteínas durante la injuria y recuperación. Varias de estas proteínas pueden asociarse de manera transiente con dominios submembranales y sufrir modificaciones covalente por lípidos. Existe evidencia creciente indicando que la palmitoilación de proteínas (S-palmitoilación) las dirige a dominios submembranales, incluyendo estructuras similares a rafts. Aunque se puede observar estos procesos en células vivas, aún carecemos de información bioquímica sobre el enlace funcional entre la compartimentalización y la función de dichas proteínas. Eso se debe a limitaciones técnicas para manipular en forma rápida y reversible la ubicación de proteínas en dominios submembranales, pero tambien a dificultades en la interpretación de experimentos hechos con proteínas modificadas para ser no-palmitoilables. Hemos desarrollado en nuestro laboratorio técnicas adecuadas para lograr la inhibición rápida y reversible de la palmitoilación, la ubicación de proteínas en rafts y la cuantificación global del estado de proteínas que pueden estar palmitoiladas (la palmitoiloma). Para estudiar el rol preciso de la S-palmitoilación y la compartimentalización, proponemos investigar esta relación in vivo e in vitro. Manipular la S-palmitoilación in situ con inhibidores permeables a células, junto con experimentos dirigidos a determinar la interacción entre liposomas artificiales y proteínas cuyo estado de palmitoilación se puede controlar in vitro, elaboraremos la relación entre acilación, compartimentalización y función. Dilucidaremos la importancia fisiológica de esta relación usando los modelos de degeneración y regeneración que tenemos funcionando en el laboratorio, es decir de hipoxia, de axotomía de nervios espinales y de intoxicación con alcohol y en colaboración con otros investigadores de la Universidad Nacional de Cuyo. Este proyecto es fundamentalmente una continuación del proyecto anterior (06/J267) con modificaciones según los hallazgos nuevos que obtuvimos durante 2007-2009, descritos en el informe final del proyecto anterior.

Summary: In recent years there has been an explosion of information regarding the importance of the formation of intracellular signalling complexes in the control of physiological functions and in pathological processes. This projects aims to advance our knowledge of how subcellular compartmentalization of signalling molecules, arid especially their presence in membrane domains known as rafts, contributes to the processes of degeneration and regeneration in the nervous system. In previous work (including the previous CIUNC project) we showed changes in the levels of a number of acylated proteins during synaptogenesis, after chronic exposure to alcohol, during alcohol withdrawal, in response to growth factors, and after axotomy. We presume that these changes are related to the specific functions of the affected proteins. There is a growing body of evidence that protein palmitoylation (S-palmitoylation) is related to their translocation to the membrane, and indeed to rafts. Thus, the activity of axon terminal proteins may be reflected directly iii their recruitment to rafts derived from neurons, or in their modification with palmitate. Although these processes may be observed in living cells, there is still a lack of information regarding the relation between protein compartmentalization and function. This arises in part from the inability to rapidly and reversibly manipulate the distribution of proteins in submembrane domains, but also from the difficulty in interpreting the results from experiments with palmitoylproteins mutated to be non-palmítoylable. In our laboratory we have developed techniques lo rapidly and reversibly inhibit palmitoylation, protein translocation to rafts and the global quantification of protein palmitoylation state (the palmitoylome). Nevertheless, there are still many pending questions regarding the role of S-palmitoylation in compartmentalization, for which reason we propose to investigate the relationship in vivo and in vitro. Manipulation of S-palmitoylation in situ with cell-permeable inhibitors, together with determination of the interaction between artificial liposome and proteins whose palmitoylation state is controlled in vitro, will allow us to address the relationship between acylation, compartmentalization and function. The physiological importance of this relationship will be elucidated using models of neuronal degeneration and regeneration currently available in this laboratory or in collaboration with other researchers in the Universidad Nacional de Cuyo, specifically hypoxia, spinal nerve axotomy and alcohol toxicity. This project is a direct continuation of the previous project (06/J267), modified according to the novel results that we produced during 2007-2009, as described in the final report to the previous project.