06/M019
Mecanismo de fusión de membranas durante la exocitosis de gránulos corticales en ovocito maduro de ratón.
Molecular mechanism of membrane fusion during cortical granule exocytosis in mouse metaphase II eggs.
Director: MICHAUT, Marcela Alejandra
Correo Electrónico: mmichaut@fcm.uncu.edu.ar
Integrantes: BELLO, Oscar Daniel; CARABAJAL, Marianela Verónica; ZANETTI, María Natalia; RODRIGUEZ PEÑA, Marcelo Javier; GAUNA, Gisel Valeria; AGUILERA, Cristina Graciela.
Resumen Técnico: Tanto el ovocito como el espermatozoide sufren exocitosis reguladas a distintos tiempos durante su encuentro. El espermatozoide libera su contenido acrosomal durante la reacción acrosomal para fecundar el ovocito, y el ovocito libera el contenido de los gránulos corticales durante la reacción cortical para bloquear la poliespermia. Teniendo en cuenta que la fusión de gránulos corticales (GC) constituye el bloqueo primario a la penetración poliespérmica, este proyecto propone identificar y estudiar las proteínas involucradas en exocitosis en otros tipos celulares – tales como SNAREs, rabs, , NSF, alpha-SNAP, sinaptotagminas, etc.- en la fusión de los GC con la membrana plasmática que tiene lugar durante la reacción cortical. Nuestra hipótesis es que el mecanismo molecular de la fusión de membranas durante la exocitosis es un mecanismo universal que comparte la maquinaria proteica básica con otras exocitosis conocidas tales como la exocitosis neuronal y acrosomal. Este proyecto propone identificar proteínas aún no identificadas por western blot y estudiar la localización de las mismas por microscopía de fluorescencia confocal utilizando anticuerpos específicos. Asimismo, propone estudiar la expresión de las proteínas identificadas durante los distintos estadíos de maduración del ovocito de ratón. Para estudiar la función de las proteínas identificadas se microinyectarán ovocitos de ratón en metafase II con proteínas recombinantes purificadas de tipo salvaje y mutadas. Se microinyectarán también anticuerpos inactivantes y toxinas como las botulínicas y tetánicas que cortan diversos SNAREs. Luego de activar partenogenéticamente los ovocitos maduros, se analizará el efecto de los diferentes tratamientos en la exocitosis de los GC por microscopía confocal de fluorescencia utilizando la lectina lens culinaris que se une específicamente al contenido de los GC. Los GC serán cuantificados utilizando el programa Image J. La microinyección de ovocitos inmaduros y maduros de ratón es un sistema muy versátil que permitirá ensayar en forma aguda todo tipo de compuestos impermeables a membranas en una célula única y viva. Si bien se sabe que la fusión de los GC con la membrana plasmática es inducida por el aumento del calcio intracelular, la importancia de este proyecto radica en que permitirá caracterizar el mecanismo que regula esta fusión de membranas y proveerá nueva información científica básica potencialmente importante en el área de la clínica reproductiva humana y animal.