06/J339

La secreción de enzimas en epidídimo de  mamíferos. Bases moleculares y su regulación hormonal.
Secretion of enzymes in mammalian epididymis. Molecular bases and hormonal regulation.

Director: SOSA ESCUDERO, Miguel Ángel
Correo Electrónico: msosa@fcm.uncu.edu.ar

Co-Director: GARGIULO, Pascual Ángel

Integrantes: CARVELLI, Lorena Flavia; BARRERA, Patricia; AGUILERA, Carolina; BORGONOVO, Janina; BANNOUD, Nadia; SARTOR, Tirso.

Resumen Técnico: Este proyecto está orientado al estudio del mecanismo de secreción de enzimas hidrolíticas por el epitelio epididimario y las moléculas que participan en este fenómeno. Estas moléculas podrían ser receptores tradicionales, como los receptores a manosa-6-fosfato (MPRs),  o se pueden proponer vías alternativas para algunas enzimas (mediadas por sortilina/prosaposina). Dado que la integridad y funcionalidad del epidídimo son hormono-dependientes, proponemos estudiar la expresión y localización de enzimas y receptores en epidídimos o células epididimarias sometidos a cambios hormonales.  En animales se estudiará las variaciones que puedan existir en la compartimentalización de enzimas y receptores por efecto de la castración, hemicastración o tratamientos con drogas anti-androgénicas. En cultivos de células epididimarias  se propone estudiar la incidencia de hormonas sobre la expresión y distribución de MPRs, sortilina/prosaposina, y enzimas hidrolíticas de tipo glicosidasa y proteolíticas de la familia de las catepsinas. Asimismo, la incidencia de prosaposina/sortilina en la distribución y procesamiento de catepsina D y en el comportamiento de MPRs serán estudiados en células con baja expresión de sortilina (“knock-down”). En ambos modelos experimentales (epidídimos o células epididimarias cultivadas) los efectos sobre la secreción epididimaria serán estudiadas por Western blot, RT-PCR, o por medición de actividad enzimática (espectrofluorometría). En células epididimarias, diferentes combinaciones de hormonas esteroidales (testosterona, estradiol, y derivados)  serán agregadas a los medios de cultivos y la distribución de las diferentes proteínas será estudiada por inmunofluorescencia o por Western blot de fracciones subcelulares separadas en gradientes de percoll.  Se pretende dilucidar si hay una regulación hormonal de la/s via/s de transporte intracelular, del procesamiento y distribución de enzimas en epidídimo, que puedan explicar disfunciones relacionadas con la maduración de los espermatozoides en epidídimo.

Summary: Mammalian epididymis plays a role in sperm maturation through its secretory activity. Among several proteins secreted by the epididymal epithelium, high amounts of acid hydrolases are found in the epididymal fluid. The role of these enzymes in the epididymal fluid is still poorly explained. This project points to elucidate the mechanism of the hydrolase secretion by the epididymis and the influence of hormonal changes. We propose to study the expression and distribution of proteins, which are involved in the selective transport of lysosomal enzymes in other cell types, such as mannose-6-phosphate receptors (MPRs) or saposin/sortilin. Distribution of these proteins and lysosomal enzymes (glycosidases and cathepsins) will be studied in epididymis of castrated or hemicastrated rats and compared with the controls. This study will be extended to male rats during perinatal development (1-90 days old) and adult rats after treatment with antiandrogenic drugs.  Hormonal treatments (androgens and estrogens) and the study of enzymes and receptors will be done in cultures of epididymal cell line.  The incidence of sortilin in transport and processing of cathepsin D will be studied in epididymal cells “knock down” in sortilin. The methods include; cell cultures, immunofluorescence, western blot, subcellular fractionation in Percoll isopicnic gradients, RT-PCR and immunoprecipitation. We hypothesize that a complex machinery regulated by hormones may be responsible of the secretory activity in mammalian epididymis.