06/J306

Inhibición de la colonización y/o toxinogénesis de Clostridium botulinum por probióticos.
Inhibition of the colonization and/or toxinogénesis of Clostridiurn botulinurn by probiotics.

Director: FERNANDEZ, Rafael Alfredo
Correo Electrónico: rfernand@fcm.uncu.edu.ar

Co-Director: de JONG, Laura Irene Teresita

Integrantes: CICCARELLI, Alberto Segundo; BAEZ, José Ricardo; MARTIN, José Luis; PAREJA, Virtudes; ABAURRE, María Eugenia; MORENO, Eva Iris; CABALLERO, Patricia Alejandra.

Resumen Técnico: Con el Objetivo General de interferir la colonización y/o toxinogénesis de C. botulinum, por probióticos y/o prebióticos, y desarrollar formulaciones para prevenir el botulismo del lactante, se plantean los siguientes Objetivos Específicos: (1) Seleccionar probióticos reconocidos. (2) Aislar bacterias ácido- lácticas (BAL) de heces de lactantes y vagina humana. (3) Seleccionar cepas de C. botulinum (Cb) de casos de botulismo del lactante (BL). (4) Ensayar in vitro interferencia del desarrollo y/o toxinogénesis de Cb en co-cultivo con BAL en medios de cultivo líquidos y sólidos. (5) Investigar con las BAL positivas para el ensayo anterior, sustancias inhibitorias solubles en el cultivo filtrado (bacteriocinas). (6) Diseñar estudios de inhibición in vivo en ratones lactantes para ensayos de inteferencia en la colonización. (7) Considerar el uso de prebióticos que puedan mejorar la colonización y actividad de los probióticos. (8) Diseñar formulaciones adecuadas para administrar s lactantes desde su nacimiento. (9) Transferir la información a la industria alimentaria/farmacéutica y establecer contratos para la producción de alimentos/medicamentos con probióticos. (10) Difundir los resultados principalmente en ámbitos científicos, población médica y población general. Hipótesis de Trabajo: Los probióticos administrados a lactantes desde su nacimiento disminuyen el riesgo de ocurrencia del BL, y en niños con BL disminuyen la duración y la gravedad de la enfermedad. Metodología Según Objetivos: (1) Selección de probióticos reconocidos: Se adquirirán algunos entre los siguientes géneros. especies y subespecies: Lactobacillus acidophilus. L. plantarum, L. casei, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L. fermentum, L. reuteri, L. helveticus, Lactococcus lactis subsp lactis y subsp. cremoris, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. adolecentis, B. longum, B. breve, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Caernobacterium divergens LV13 y Saccharomyces boulardii. (2) Aislar BAL de heces de lactantes y vagina humana: Preferentemente de niños alimentados a pecho, hasta el año de vida, de centros asistenciales públicos y privados. (3) Seleccionar cepas de C. botulinum de casos de BL, de nuestros propios archivos. (4) Ensayos in vitro: Cb en cocultivo con BAL en diferentes proporciones en medios de cultivo líquidos y sólidos. Para desarrollo de Cb métodos cualitativos en medios sólidos por estrías cruzadas en superficie para detectar zonas de inhibición. Métodos semicuantitativos en medios sólidos, con siembra en masa de Cb en el medio fundido, se deja solidificar en placas de Petri, se realizan perforaciones para depositar alícuotas de cultivo líquido de BAL a determinadas concentraciones (ufc/ml) y diluciones. El resultado se comprueba por halos de inhibición alrededor de las perforaciones. En medio líquido, se siembran en 20 ml de medio estéril proporciones variables de CB y BAL y se evalúa el crecimiento relativo de cada uno luego de incubación, por recuento de ufc diferencial comparado con los testigos en monocultivos (ver Tabla 1 en Anexo). La interferencia de la toxinogénesis de Cb se determina comparando los niveles de toxina en el caldo de los cocultivos y de los testigos en monocultivo. (5) Investigar presencia de sustancias inhibitorias solubles producidas por los BAL en los cultivos, previa filtración esterilizante. (6) Puesta a punto de la técnica para la colonización de ratones lactantes con bacterias probióticas y posterior o concomitante desafío con distintas dosis de esporas de Cb para investigar la interferencia de la colonización y/o toxinogénesis de CB. (7) Se evaluará la necesidad /o factibilidad del uso de prebióticos. (8 y 9) Se entrevistarán propietarios de industrias alimentarias (principalmente lácteas) farmacéuticas, para asesoramiento, transferencia de información y eventual concreción de contratos para la producción de alimentos/medicamentos con probióticos para lactantes menores de 1 año de vida. (10) Difusión de resultados en ámbitos científicos, médicos y población general. Por publicaciones. comunicaciones en congresos y conferencias. Actividades de extensión en medios de difusión pública y establecimientos educativos (Provecto de Voluntariado 2009. Mm. Salud Nación), con alunmos de Medicina (FCMédicas), de Comunicación Social (FCPolíticas) y del Instituto Tecnológico Universitario, todos de la UNCuvo: y de la FPeriodismo de la UMaza. Nota: Los datos serán analizados estadísticamente por la Dra. Elcira Maneschi (FCM. UNCuyo). Transferencia y beneficiarios. Transferencia: Publicaciones con/sin referato en revistas científicas de amplia circulación nacional e internacional, comunicaciones en reuniones científicas. Conferencias en ámbitos científicos y populares. Actividades de extensión en medios de difusión pública y establecimientos educativos (Proyecto de Voluntariado). Beneficiarios: Lactantes, nacidos vivos de hasta 1 año de edad, en principio de la región, y extensión a las regiones colindantes y más lejanas. Sistema de salud: Descompresión y ahorro económico. La atención de los casos moderados (preferible) y graves (obligatorio) debe ser en unidades de cuidados intensivos (UCI), con acceso a respiradores mecánicos, en los casos más graves por largos períodos, a veces más de 30 días.

Summary: Our main objective is to investigate the interference of colonization and/or toxinogónesis of C. botulinum, by probiotics and to develop formulations to prevent the infant botulism (IB). Some strains of probiotics between recognized species will be selected (like Lactobacillus acidophilus. L. plantarum, L. casei, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L. fermentum. L. reuteri, L. helveticus, Lactococcus lactis subsp lactis and subsp. cremoris, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. adolecentis, B. longum, B. breve, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Caernobacterium divergens LV13 and Saccharomices boulardii), strains of acid-lactic bacteria (ALB) from feces of breast feeding babies, and from human vagina: and strains of C. botulinum (Cb) of IB cases. It will be tried in vitro in co-cultures with Cb an ALB at different proportions in liquid and solid media. Our hypothesis is that probiotics administered to suckling babies, from their birth and less than one year of age, would diminish the risk of occurrence of the IB, and during the disease the duration and the gravity would diminish too. In addition, we will investigate the presence of inhibitory soluble substances produced by ALB in the broth cultures sterilized by filtration. A model in suckling mice for the intestinal colonization with probiotic bacteria will be completed. We will challenge the mice after colonization with probiotics or concomitant with it, at different doses of Cb spores, to investigate the interference of the colonization and/or toxinogénesis of Cb. With the results of this project suckling babies will be obviouslv beneficiated, and the health system will get a significant economic saving, since the moderate and serious cases must be admitted to intensive care units with access to mechanical ventilation, in the most serious cases by long periods (sometimes more man 30 days). According to Arnon et al. (2006), the average of the hospital cost by each baby committed between 4 and 7 days is of approximately US$ 67.000.