06/J335

Influencia de la infección con Leishmania braziliensis sobre la expresión de Rab22 en macrófagos y células no fagocíticas.
Influence of the infection with Leishmania braziliensis. on the expression of Rab22 in macrófagos and cells not fagocíticas.

Director: SALOMON, María Cristina
Correo Electrónico: csalomon@fcm.uncu.edu.ar

Co-Director: ARENAS, Graciela Nora

Integrantes: TONELLI, Rosa Lydia; CARRIZO, Liliana Carmen; JOFRE, Claudio Adrián; MANINI, Vanina.

Resumen Técnico: Los flagelados del género Leishmania se presentan en dos estadios morfológica y  funcionalmente bien diferenciados. Los promastigotes, extracelulares que se encuentran libre en el sistema digestivo del insecto vector y la forma amastigote, intracelular, que parasita las células fagocíticas de mamíferos. Los promastigotes son inoculados en gran cantidad al torrente sanguíneo del mamífero por la picadura del insecto pero son rápidamente destruidos por el sistema inmune del hospedador. Los parásitos que alcanzan a ingresar al macrófago, ahora amastigotes, se reproducen activamente en el interior de una vacuola parasitófora evadiendo la acción microbicida del macrófago. Los mecanismos que permiten la supervivencia del parásito en el fagocito no están aún bien determinados. El objetivo de nuestro proyecto es contribuir al entendimiento de la relación parásito-hospedador mediante el estudio de moléculas que podrían estar asociadas tanto a la internalización de promastigotes como a la formación y el establecimiento de la vacuola parasitófora y por lo tanto a la reproducción de los amastigotes en su interior. Nuestra hipótesis de trabajo es que Leishmania induciría alteraciones en el tráfico intracelular normal del macrófago. Por otra parte, las proteínas Rab son pequeñas GTPasas organela específicas que actúan como  potentes reguladores del transporte intracelular. El presente proyecto se integra en una línea de investigación en la que se han obtenido resultados acerca de las funciones de algunas proteínas Rab (Rab22a, Rab3a, Rab5) en la vía endocítica. Rab5 interviene en la fusión de membranas endosomales y para Rab22a se ha propuesto un rol en el direccionamiento de moléculas a nivel de endosomas temprano en el tráfico intracelular. Hemos obtenido un modelo experimental de infección con Leishmania braziliensis en macrófagos que nos permite estudiar la internalización de los promastigotes y la reproducción en la vacuola parasitófora al estadio de amastigotes. Por otra parte, hemos observado, una notable diferencia en la cinética de internalización de promastigotes entre macrófagos y células no fagocíticas (VERO) como también diferentes patrones de expresión de Rab22 en ambos tipos celulares. Sin embargo, en todos los casos, realizamos la estimación de la fagocitosis de un modo indirecto por la observación de frotis teñidos con Giemsa en los que determinamos el porcentaje de infección a los distintos tiempos estudiados. Por este motivo y para avanzar en esta línea nos es necesario contar con un sistema eficiente para identificar al parásito en el interior del fagocito de una manera específica y mas precisa que la coloración de Giemsa. Nos proponemos generar un Ac contra los antígenos somáticos de Leishmania braziliensis y conjugarlo con un fluorocromo para poder identificar indiscutiblemente si el cambio de expresión de la proteína Rab22 se cumple en las células parasitadas en ambos tipos celulares. Este Ac florescente podrá utilizarse en posteriores experimentos constituyendo una valiosa herramienta para el estudio de los factores que permiten la evasión parasitaria a la acción microbicida del fagocítico, etapa crítica en el establecimiento de la infección en el humano.

Summary: The flagellated ones of the genre Leishmania present themselves in two morphologic and functionally well differentiated stadiums. The promastigotes, extracellular that find vector and the form free in the digestive system of the insect amastigote, intracelular, that parasite the cells fagocíticas of mammals. The promastigotes are inoculated in big quantity to the blood stream of the mammal by the sting of the insect but they are rapidly destroyed by the immune system of the hospedador. The parasites that manage to deposit the macrófago, now amastigotes, reproduce actively inside a vacuola parasitófora evading the action microbicida of the macrófago. The mechanisms that allow the survival of the parasite in the fagocito are not still well certain. The target of our project is to contribute to the understanding of the relation parasite - hospedador by means of the study of molecules that might be associated both with the internalización of promastigotes and with the formation and the establishment of the vacuola parasitófora and therefore with the reproduction of the amastigotes in his interior. Our hypothesis of work is that Leishmania would induce alterations in the traffic intracelular normally of the macrófago. We have obtained an experimental model of infection with Leishmania braziliensis in macrófagos that there allows us to study the internalización of the promastigotes and the reproduction in the vacuola parasitófora to the stadium of amastigotes. On the other hand, we have observed, a notable difference in the kinetics of internalización of promastigotes between macrófagos and cells not fagocíticas (VERO) as also different bosses of expression of Rab22 in both cellular types. For this motive and for advancing in this line it is necessary to be provided with an efficient system to identify to the parasite inside the fagocito of a way specific and more precise than the coloration of Giemsa to us. We propose to generate an Ac against the antigens somáticos of Leishmania braziliensis and bring together it with a fluorocromo to be able to identify indisputably if the change of expression of the protein Rab22 is fulfilled in the cells parasitadas in both cellular types. This Ac florescente will be able to be used in later experiments constituting a valuable tool for the study of the factors that allow the parasitic evasion the action microbicida of the fagocítico, critical stage in the establishment of the infection in the human being.