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Respuesta de los canales de sodio a la hipoxia hipobárica crónica.
Response of a sodium channel hipobaric hypoxia chronicle.

Director: SALDEÑA, Teobaldo Antonio
Correo Electrónico: patchuncuyo@yahoo.com.ar

Co-Director: SARAVI, Femando Daniel

Integrantes: MICHAUT, Marcela Alejandra; ITUARTE, Leonor María Ester; VIERA, Teresa Beatriz; POCOGNONI, Diego; ABAL, Javier.

Resumen Técnico: Se emplearán cardiomicitos aislados de ratas macho adulto, Wistar-Hokkaido. Se colocarán en una cámara de hipoxia hipobárica con régimen de 10 horas en cámara por 14 horas en atmósfera normal. Se comprobará el efecto de la hipoxia hipobárica crónica obteniendo el hematocrito en el momento de la cirugía para la extracción y disección del corazón. Se perfundirá el corazón con soluciones que restablecen la actividad cardíaca en un equipo de perfusión tipo Langendorff con flujo continuo a 37°C. Se perfundirá luego la preparación con soluciones con bajo calcio y con colagenasa para disgregar el miocardio con el objeto de obtener las células aisladas. Las células obtenidas se transferirán a una cámara de estudio con perfusión continua a temperatura controlada con las soluciones correspondientes a cada determinación. Cardiomiocitos controles y de ratas sometidas a hipoxia hipobárica crónica serán aislados, montados en portaobjetos o placas de Petri según corresponda para la aplicación de tres técnicas: 1) Determinación de corriente de Nav con patch-clamp en configuración wholecell. Se realizarán registros eléctricos en condiciones de clampeo de diferencia de potencial. Se aplicarán distintos protocolos de pulso de despolarización para obtener la corriente total a través de la membrana de cardiomiocitos antes y después de la aplicación de 200nM de tetrodotoxina a los cardiomiocitos control y a los experimentales. Se compararán los registros de las corrientes iónicas total en células con hipoxia crónica comparándolas con los registros de rata normobáricas. Los datos se obtendrán el programa pclamp6 y se analizarán posteriormente con el soft clampfit de Axon Intruments. El análisis estadístico se realizará con el programa Origin. 2) Localización por Inmunofluorescencia del receptor Nav. Los cardiomiocitos control y los experimentales serán permeabilizados, fijados y bloquearlos. Serán incubados en presencia del anticuerpo primario. Se lavarán e incubarán con el anticuerpo secundario fluorescente para ser observados. Las imágenes fluorescentes serán obtenidas en un microscopio confocal. 3) Análisis por Western Blot. Se prepararán homogenatos celulares de cardiomiocitos controles y experimentales en presencia de inhibidores de proteasas y se determinara la concentración proteica por el método de Bradford. Las muestras serán corridas en geles de poliacrilamida y transferidas electroforéticamente en membranas de nitrocelulosa. Después de ser bloqueadas, las membranas serán incubadas con el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo. Luego de ser lavadas, las membranas serán incubadas con el anticuerpo secundario conjugado y los sitios de reacción antígeno-anticuerpo serán visualizados usando un sistema quimioluminiscente y expuestas a películas de rayos X. A los resultados obtenidos en la técnica 1) se les aplicará el método de linealización de funciones para obtener la función matemática exponencial de la corriente de sodio a partir de los datos experimentales. Se compararán los valores de las constantes de la función exponencial obtenidas de los registros experimentales en cardiomiocitos control y en cardiomiocitos de ratas en hipoxia hipobárica crónica. Se relacionarán dichos valores con los resultados obtenidos en las técnicas 2) Y 3) para comprobar si la hipoxia hipobárica crónica tiene como respuesta fisiológica un aumento de la densidad de canales de Na. Los posteriores desafíos son: 1) determinar si existe una subunidad determinada del canal Na que se sintetice preferentemente ante una hipoxia hipobárica crónica, 2) realizar la comparación en miocitos de ratas con variaciones en la concentración de sodio en la dieta. Se comunicarán los resultados en congresos, en clases de grado y de postgrado y a través de publicaciones.

Summary: Be used cardiomicitos isolated from adult male rats, Wistar-Hokkaido. Be placed in a hypobaric hypoxia chamber boarding house for 10 hours at 14 hours in normal atmosphere. That the effect of chronic hypobaric hypoxia obtaining the hematocrit at the time of surgery for the removal and dissection of the heart. Perfundirá heart is with solutions that restore the heart activity in a Langendorff perfiision with constant flow rate at 37 O C. Was then preparing solutions with low calcium and collagenasse to disaggregate the myocardium in order to obtain isolated celis. The cells obtained are transferred to a chamber study with continuous inflision at a controlled temperature with solutions for each detennination. Cardiomyocytes of controls and rats subjected to chronic hypobaric hypoxia are isolated, mounted on slides or Petri dishes as required for the implementation of three techniques. 1) Determining current Na patch-clamp whole-cell configuration. Electrical records were made under conditions of clamping of potential difference. Apply different protocois pulse depolarization to obtain the total flow through the membrane of cardiomyocytes before and after application of 200nM of Tetrodotoxin to the experimental and control cardiomyocytes. Compare the records of the total ionic currents in cells with chronic hypoxia compared with the records of rat normobáricas. Data were obtained pclamp6 and the program will be analyzed later with the soft clampfit of Axon Intruments. Statistical analysis was performed with the program Origin.2) Immunofluorescence Localizacion Na receiver. The experimental and control cardiomyocytes permeabilise will set and block. Are incubated in the presence of primary antibody. Washed and incubated with fluorescent secondary antibody to be observed. The images are obtained in a fluorescent confocal microscope. 3) Analysis by Western Blot. Be prepared homogenatos ceil control and experimental cardiomyocytes in the presence of protease inhibitors and protein concentration was determined by the method of Bradford. The samples are run on polyacrylamide geis and transferred electrophoretically to nitrocellulose membranes. Afier being blocked, the membranes are incubated with primary antibody diluted in blocking solution. Afier being washed, the membranes are incubated with secondary antibody conjugate and the sites of antigen-antibody reaction is visualized using a chemiluminescent system and exposed to X-ray films The results obtained in the art 1) will apply the method of linearization functions for the exponential mathematical function of the flow of sodium from the experimental data. Compare the values of the constants of the exponential function from the experimental records in control cardiomyocytes and in cardiomyocytes of rats in chronic hypobaric hypoxia. Will relate these values to the results of the techniques 2) and 3) to see if chronic hypobaric hypoxia is a physiological response to increased density of Na channeis.